Жёстко регулируемая система индуцируемой экспрессии для создания условных нокаутов генов и доминант-негативного генетического анализа у трипаносомы Брюса

В векторах первого поколения для индуцируемой экспрессии у Trypanosoma brucei один промотор, регулируемый тетрациклином, обеспечивал экспрессию исследуемого гена одновременно с геном лекарственной устойчивости, необходимым для отбора клеток с интегрированной конструкцией (Wirtz E, Clayton CE. Science 1995; 268:1179–1183). Поскольку и лекарственная устойчивость, и экспрессия исследуемого гена зависели от активности регулируемого промотора, этот подход нельзя было использовать для индуцируемой экспрессии токсичных продуктов. Мы разработали систему с двумя промоторами, расположенными навстречу друг другу: конститутивным промотором T7 и регулируемым тетрациклином промотором PARP, которые обеспечивают экспрессию селективного маркера и исследуемого гена соответственно. Трансформанты с такими векторами легко получать без тетрациклина в клеточных линиях кровяной или проциклической формы T. brucei, одновременно экспрессирующих РНК-полимеразу T7 и репрессор Tet; во всех случаях экспрессия регулируется тетрациклином в диапазоне 10³–10⁴ раз. Средний фоновый уровень экспрессии люциферазного репортера без индукции не превышает одной молекулы на клетку, что позволяет применять доминант-негативные подходы, основанные на индуцируемой экспрессии токсичных продуктов. Строгая регуляция также позволяет получать функциональные нокауты генов, регулируя экспрессию исследуемого гена в линии с нулевой мутацией.