Быстрая очистка комплекса желудочной H+/K+-АТФазы методом аффинной хроматографии на лектине томата

Ранее было показано, что лектин томата специфически связывается с мембранным гликопротеином массой 60–90 кДа тубуловезикул париетальных клеток — β-субъединицей желудочной H+/K+-АТФазы (протонной помпы) [Callaghan, Toh, Pettitt, Humphris & Gleeson (1990) J. Cell Sci. 95, 563–576; Toh, Gleeson, Simpson, Mortiz, Callaghan, Goldkorn, Jones, Martinelli, Mu, Humphris, Pettitt, Mori, Masuda, Sobieszczuk, Weinstock, Mantamadiotis & Baldwin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6418–6422]. В настоящей работе это взаимодействие использовали для разработки быстрого одностадийного метода очистки активного комплекса протонной помпы желудка свиньи. Сначала обогащённые H+/K+-АТФазой мембраны, полученные из микросом желудка свиньи центрифугированием в градиенте плотности, экстрагировали 1%-ным Triton X-100 и пропускали через колонку с 1 мл томатного лектина на Sepharose 4B. В связавшемся с колонкой материале, элюированном 20 мМ хитотриозой, при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия выявлялась основная полоса с кажущейся молекулярной массой 95 кДа и слабая широкая полоса в диапазоне 60–90 кДа. После обработки связавшегося материала N-гликаназой появлялась полоса 35 кДа, соответствующая размеру белкового ядра гликопротеина массой 60–90 кДа — β-субъединицы. Оба компонента были идентифицированы как α-субъединица массой 95 кДа и β-субъединица массой 60–90 кДа желудочной H+/K+-АТФазы на основании иммунореактивности с моноспецифическими антителами и последовательностей триптических пептидов материала, связавшегося с лектином томата. β-субъединица присутствовала в приблизительно эквимолярном количестве с каталитической α-субъединицей. После солюбилизации в 1%-ном Triton X-100 желудочная H+/K+-АТФаза не сохраняла активности. Напротив, солюбилизация очищенных центрифугированием в градиенте плотности мембран в неионном детергенте C12E8 с последующей хроматографией экстракта на томатном лектине, связанном с Sepharose 4B, позволила очистить комплекс желудочной H+/K+-АТФазы, обладавший K+-зависимой фосфатазной активностью. Это первое сообщение о быстром способе очистки частично активного солюбилизированного комплекса желудочной H+/K+-АТФазы.