Моделирование нарушенного заживления ран с использованием тканеинженерных кожных конструкций и мультифотонной микроскопии

Введение: Келоидные и гипертрофические рубцы возникают вследствие нарушенного заживления ран и могут осложнять любые хирургические вмешательства и травмы. Исследования нарушенного заживления ран ограничивались изучением факторов роста, предшественников коллагена и синтеза ДНК в простых системах in vitro, требующих удаления или разрушения клеток либо факторов в культуральной среде. Мультифотонная микроскопия (MPM) позволяет использовать эндогенные хромофоры, такие как коллаген и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), для получения тонких оптических срезов толстых живых тканей без красителей. Эндогенные сигналы генерации второй гармоники (SHG) в коллагене можно регистрировать для получения изображений методом MPM.

Цель: Представить новую модель заживления ран, позволяющую исследовать активность фибробластов, полученных из келоидов, и продукцию коллагена в одной и той же интактной тканеинженерной конструкции в динамике.

Методы: Искусственные тканевые конструкции RAFT получали, суспендируя фибробласты из келоидной или нормальной дермы в геле коллагена I типа и формируя поверх него слой кератиноцитов; конструкции культивировали на границе воздух—жидкость. С помощью MPM получали изображения коллагена методом SHG в интактных тканевых конструкциях с нормальными фибробластами или фибробластами, полученными из келоидов. Затем конструкции рассекали скальпелем. В течение 8 дней серийно получали изображения методом MPM и фазово-контрастной микроскопии, чтобы отслеживать изменения внеклеточного матрикса после ранения искусственной кожи.

Результаты: Тканеинженерные конструкции формировали два слоя, напоминающие дерму и эпидермис кожи человека. При фазово-контрастной микроскопии наблюдали миграцию кератиноцитов в дефект, образовавшийся после рассечения скальпелем. После ранения конструкции постепенно сокращались. На изображениях MPM, полученных методом SHG, выявлялось отложение коллагена в тканевых конструкциях после ранения. Конструкции с фибробластами, полученными из келоидов, откладывали коллаген быстрее, чем конструкции с нормальными фибробластами.

Выводы: Описанная модель MPM позволяет многократно наблюдать одни и те же интактные образцы без фиксации и цитотоксичных красителей. Кроме того, она демонстрирует биологическую активность искусственных тканевых конструкций RAFT.