Получение белка методом автоиндукции в культурах высокой плотности при встряхивании

Индуцируемые системы экспрессии, в которых РНК-полимераза T7 транскрибирует кодирующие последовательности, клонированные под контролем промотора T7lac, позволяют эффективно получать широкий спектр белков в клетках Escherichia coli. Изучение факторов, влияющих на стабильность, рост и индукцию штаммов с экспрессией под контролем T7 в колбах при встряхивании, показало, что эпизодическая непреднамеренная индукция экспрессии в сложных питательных средах, ранее описанная другими авторами, почти наверняка обусловлена небольшими количествами лактозы. Глюкоза предотвращает индукцию лактозой посредством хорошо изученных механизмов. Аминокислоты также подавляют индукцию лактозой в логарифмической фазе роста, а высокая интенсивность аэрации препятствует индукции при низких концентрациях лактозы. Эти наблюдения и метаболическая стабилизация pH позволили разработать надежные неиндуцирующие и автоиндуцирующие среды, в которых периодические культуры достигают высокой плотности. Штаммы с экспрессией, выращенные до насыщения в неиндуцирующих средах, сохраняют плазмиду и остаются полностью жизнеспособными в холодильнике в течение нескольких недель, что упрощает параллельную подготовку большого числа криостоков и позволяет длительно использовать рабочие культуры. Автоиндукция обеспечивает эффективный параллельный скрининг большого числа клонов по экспрессии и растворимости, поскольку культуры достаточно инокулировать и выращивать до насыщения; при этом выход целевого белка обычно в несколько раз выше, чем при стандартной индукции IPTG. Разработаны автоиндуцирующие среды для мечения белков селенометионином, 15N или 13C, а также для получения целевых белков путем индукции арабинозой экспрессии РНК-полимеразы T7 с промотора pBAD в штамме BL21-AI. Мечение селенометионином было одинаково эффективным у часто используемого ауксотрофного по метионину штамма B834(DE3) (установлено, что он относится к metE) и у прототрофного штамма BL21(DE3).