Сверхвысокое разрешение при визуализации методом флуоресцентной микроскопии локализации с фотоактивацией

Биологические структуры различаются по размеру на многие порядки величины, однако разрешение микроскопии видимого света в дальней зоне ограничено. Разработан новый метод флуоресцентной визуализации, позволяющий определять пространственное распределение большого числа флуоресцентных молекул на расстояниях меньше классического дифракционного предела. При флуоресцентной микроскопии локализации с фотоактивацией (FPALM) за одно измерение анализируют тысячи одиночных флуорофоров, локализуя небольшое их число за раз при низкой интенсивности возбуждения. Чтобы контролировать количество видимых флуорофоров в поле зрения и обеспечить расстояние между оптически активными молекулами, значительно превышающее ширину функции рассеяния точки, используют фотоактивируемые флуоресцентные молекулы — в данном случае фотоактивируемый зелёный флуоресцентный белок (PA-GFP). У этих молекул скорость активации регулируется интенсивностью активирующего освещения: неактивные нефлуоресцентные молекулы активируют высокочастотным лазером (405 нм), после чего они флуоресцируют при возбуждении на более низкой частоте. Флуоресценцию регистрируют ПЗС-камерой, затем молекулы либо обратимо инактивируют, либо необратимо удаляют из поля зрения посредством фотоблекания. Скорость фотоблекания регулируют интенсивностью лазера, используемого для возбуждения флуоресценции, — в данном случае аргон-ионного лазера. Поскольку в каждый момент времени видна лишь небольшая часть молекул, их положение можно определить с высокой точностью. При регистрации всего около 100 фотонов от одной молекулы точность локализации может до 10 раз превышать разрешение; конкретное значение зависит от уровня фонового сигнала. При визуализации PA-GFP на стекле методом FPALM обнаружены неоднородности размером в десятки нанометров. Изображения FPALM сопоставили с изображениями тех же молекул, полученными методом широкопольной флуоресцентной микроскопии. Изображения PA-GFP на террасированной поверхности кристалла сапфира, полученные методом FPALM, сравнили с данными атомно-силовой микроскопии. Полная ширина объектов на половине максимума составляла около 86 ± 4 нм, что значительно меньше ожидаемого дифракционно-ограниченного оптического разрешения. С помощью FPALM также определили число флуоресцентных молекул и распределение их яркости. Этот новый метод открывает возможности для изучения многих биологических вопросов, исследование которых ранее ограничивалось разрешением микроскопа.