Эффективный одностадийный протокол сайт-направленного мутагенеза плазмид: делеции, вставки, одиночные и множественные мутации

Введение: Мутагенез играет важную роль в молекулярной биологии и биохимии. Его также применяют в энзимологии и исследовании белков для получения белков, более удобных для изучения биофизическими методами. Возможность быстро и избирательно заменять аминокислотные остатки в белке важна для изучения его функций и механизмов действия. Несмотря на разработку множества методов сайт-направленного мутагенеза, сохраняется потребность в простом, быстром и широко применимом методе.

Результаты: Мы разработали протокол сайт-направленного мутагенеза плазмид, сохранивший простоту одностадийного метода QuikChange, но обладающий повышенной эффективностью и расширенными возможностями для мутагенеза нескольких участков. В модифицированном протоколе использовали новый дизайн праймеров, который улучшал их гибридизацию с матрицей за счёт предотвращения образования праймер-димеров, а также позволял использовать вновь синтезированную ДНК в качестве матрицы в последующих циклах амплификации. По нашему мнению, именно эти два фактора обеспечили более эффективную амплификацию и возможность мутагенеза нескольких участков.

Выводы: Модифицированный протокол значительно повысил эффективность внесения одиночных мутаций и позволил легко получать крупные вставки, делеции и укороченные варианты, а также вносить множественные мутации за один эксперимент — возможности, недоступные при использовании стандартного метода QuikChange. Кроме того, для нового протокола требовалось значительно меньше исходной ДНК, что упрощало её расщепление ферментом DpnI после ПЦР и повышало общую эффективность и надёжность метода. С его помощью были получены мутации в одном участке, множественные мутации в отдельных участках, а также комбинированные мутации со вставкой и делецией. Результаты показали, что новый протокол повышает общую долю успешных экспериментов без дополнительных затрат на реагенты по сравнению с базовым методом QuikChange.