Получение крупных однослойных везикул методом быстрой экструзии: характеристика распределения размеров, захваченного объёма и способности поддерживать мембранный потенциал

Продемонстрирован метод быстрого получения крупных однослойных везикул путём многократной экструзии многослойных везикул под умеренным давлением (≤500 фунт/дюйм²) через поликарбонатные фильтры с размером пор 100 нм. В сочетании с протоколами замораживания–оттаивания, когда это необходимо, данный метод позволяет получать однослойные везикулы диаметром 60–100 нм с захваченным объёмом около 1–3 мкл/мкмоль фосфолипида. К преимуществам метода относятся отсутствие органических растворителей и детергентов, возможность использовать высокие концентрации липидов — до 300 мкмоль/мл — и достигать высокой эффективности захвата — до 30%. Кроме того, процедура получения таких везикул, обозначаемых как LUVET (крупные однослойные везикулы, полученные методом экструзии), выполняется быстро (время приготовления ≤ мин) и позволяет получать крупные однослойные везикулы из широкого спектра липидов и их смесей. В качестве примера практической ценности этого метода охарактеризованы системы LUVET, в которых в ответ на трансмембранный градиент Na⁺/K⁺ (K⁺ внутри) формируется мембранный потенциал (ΔΨ). С помощью липофильного катиона метилтрифенилфосфония (MTPP⁺) показано, что в присутствии калиевого ионофора валиномицина в LUVET из соевого фосфатидилхолина быстро формируется калиевый диффузионный потенциал (ΔΨ < −100 мВ). Полученные значения Δψ хорошо соответствуют градиенту концентрации K⁺ по обе стороны мембраны; также показано, что снижение Δψ со временем зависит от потока Na⁺ внутрь везикул.