Быстрая генетическая идентификация и картирование рДНК, энзиматически амплифицированной из нескольких видов Cryptococcus

Подробный рестрикционный анализ многих образцов часто требует значительных затрат времени и усилий на выделение ДНК, рестрикционное расщепление, Саузерн-блоттинг и гибридизацию. Мы описываем новый подход, в котором для быстрого упрощённого рестрикционного типирования и картирования ДНК из множества различных изолятов используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Фрагменты ДНК длиной до 2 килобаз эффективно амплифицировались из грубых ДНК-препаратов нескольких патогенных видов Cryptococcus, включая C. neoformans, C. albidus, C. laurentii и C. uniguttulatus. Расщепление и электрофорез продуктов ПЦР с использованием рестрикционных ферментов с частыми сайтами узнавания давали сложные рестрикционные фенотипы (отпечатки), которые часто были уникальны для каждого штамма или вида. С помощью ПЦР мы амплифицировали и анализировали вариабельность рестрикционных паттернов в трёх основных участках повторов рибосомной ДНК (рДНК) этих грибов. Подробное картирование многих рестрикционных сайтов в локусе рДНК было выполнено по анализу отпечатков пальцев для последовательно более длинных ПЦР-фрагментов, имевших общий сайт праймера на одном конце. По данным ПЦР-«отпечатков», рДНК 19 изолятов C. neoformans не демонстрировала вариабельности по четырём изученным рестрикционным ферментам. Другие виды Cryptococcus показывали различную степень вариабельности рестрикционных паттернов в своих рДНК и были генетически отличны от C. neoformans. Праймеры ПЦР, использованные в этом исследовании, также успешно применялись для амплификации рДНК других патогенных и непатогенных грибов, включая виды Candida, и, по-видимому, имеют широкую применимость для клинической диагностики и других исследований.