Набор инструментов CRISPR/Cas9 для многолокусного редактирования генома растений

Введение: Для ускорения внедрения системы CRISPR/Cas9 (коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами, и белка 9, ассоциированного с CRISPR) в различные виды растений необходим набор инструментов с дополнительными селективными маркерами для растений, большим числом модулей направляющей РНК и более простыми способами сборки одной или нескольких кассет её экспрессии.

Результаты: Мы разработали набор бинарных векторов CRISPR/Cas9 на основе векторов pGreen или pCAMBIA и набор векторов с модулями направляющей РНК — инструменты для многолокусного редактирования генома растений. Для сборки конечных конструкций, содержащих Cas9 с кодонной последовательностью, оптимизированной для кукурузы, и одну или несколько направляющих РНК, требуется только рестриктаза BsaI; сборку с высокой эффективностью можно выполнить всего за один этап клонирования. Набор проверили на протопластах кукурузы, трансгенных линиях кукурузы и трансгенных линиях арабидопсиса; он продемонстрировал высокую эффективность и специфичность. Кроме того, с его помощью у трансгенных проростков арабидопсиса поколения T1 выявили целевые мутации в трёх генах. Мутации сразу в нескольких генах передавались следующему поколению.

Выводы: Мы разработали набор инструментов, который упрощает временную или стабильную экспрессию системы CRISPR/Cas9 у различных видов растений. Он будет полезен для исследований растений, поскольку позволяет с высокой эффективностью получать мутанты с мутациями в нескольких генах.