Сайт-направленный мутагенез методом перекрывающегося удлинения с использованием полимеразной цепной реакции

Перекрывающееся удлинение представляет собой новый подход к генной инженерии. С помощью комплементарных олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и полимеразной цепной реакции получают два фрагмента ДНК с перекрывающимися концами. Затем эти фрагменты объединяют в последующей реакции «слияния», в ходе которой перекрывающиеся концы отжигаются, и 3'-концевой перекрывающийся участок каждой цепи служит праймером для удлинения комплементарной цепи в направлении 3'. Полученный продукт слияния дополнительно амплифицируют методом ПЦР. Специфические изменения нуклеотидной последовательности можно вводить, включая соответствующие замены нуклеотидов в перекрывающиеся олигонуклеотидные праймеры. С использованием этого метода сайт-направленного мутагенеза были получены, клонированы и исследованы три варианта гена главного комплекса гистосовместимости мыши класса I. Скрининг мутантных клонов показал эффективность мутагенеза не менее 98%. Во всех секвенированных клонах содержались требуемые мутации; кроме того, выявлена низкая частота случайных замен, оцениваемая примерно как 1 на 4000 нуклеотидов. Этот метод значительно превосходит стандартные методы сайт-направленного мутагенеза, поскольку позволяет гораздо быстрее и проще получать мутантный продукт с эффективностью, близкой к 100%.