Оценка и разработка полногеномных скринингов нокаутов с использованием CRISPR/SpCas9

Адаптация технологии CRISPR/SpCas9 для линий клеток млекопитающих преобразует исследования функциональной геномики человека. Пуловые библиотеки направляющих РНК (гРНК), нацеленных на гены человека, кодирующие белки, и встроенных в вирусные векторы, используют для систематической инактивации генов в различных линиях раковых и иммортализованных клеток человека с целью определить, приводят ли такие нокауты к снижению клеточной приспособленности. Предыдущие исследования показали, что в аналогичных анализах CRISPR-скрининги чувствительнее и специфичнее скринингов с использованием пуловых библиотек shRNA, однако в настоящее время конструкции CRISPR-библиотек и экспериментальные протоколы существенно различаются. В настоящем исследовании мы повторно проанализировали 17 полногеномных скринингов нокаутов в линиях клеток человека, выполненных тремя исследовательскими группами с использованием трёх различных полногеномных библиотек гРНК. С помощью алгоритма Bayesian Analysis of Gene Essentiality для выявления эссенциальных генов мы уточнили и расширили ранее определённый нами набор основных эссенциальных генов человека — с 360 до 684 генов. Расширенный набор основных эссенциальных генов CEG2 в сочетании с эмпирическими данными, полученными в шести CRISPR-скринингах нокаутов, был использован для разработки библиотеки гРНК с оптимизированными последовательностями — Toronto KnockOut версии 3.0 (TKOv3). Мы продемонстрировали высокую эффективность этой библиотеки при сравнении с эталонными наборами эссенциальных и неэссенциальных генов, а также с результатами других скринингов, выполненных с использованием аналогичных подходов. Оптимизированная библиотека TKOv3 в сочетании с эталонным набором CEG2 представляет собой эффективную, высокооптимизированную платформу для проведения и оценки скринингов нокаутов генов в линиях клеток человека.