Прокариотическая экспрессия и функциональная идентификация скваленсинтазы частухи восточной и разработка иммунологического метода ее выявления

Скваленсинтаза частухи восточной катализирует превращение фарнезилдифосфата (FPP) в сквален и является ключевым регуляторным ферментом, направляющим поток углерода на биосинтез протостановых тритерпенов. Для дальнейшего изучения функции и экспрессии гена AoSS открытую рамку считывания гена скваленсинтазы (номер доступа JX866770) частухи восточной субклонировали в вектор прокариотической экспрессии pCzn1 и индуцировали экспрессию AoSS в клетках Escherichia coli BL21(Roseta). Слитый белок преимущественно накапливался в виде телец включения; после очистки был получен белок высокой степени чистоты. Функциональность белка проверили с помощью ферментативной реакции in vitro: было показано, что он катализирует превращение FPP в сквален. Для изучения экспрессии AoSS в частухе восточной очищенным белком иммунизировали кроликов и получили поликлональные антитела, которые затем очистили. По данным иммуноферментного анализа титр антител превышал 1:51 200; иммуноблоттинг подтвердил их высокую специфичность. С помощью полученных антител провели иммунологический анализ содержания AoSS в разных органах растения: максимальный уровень экспрессии выявлен в клубнях, затем в листьях, минимальный — в корнях. Создание вектора прокариотической экспрессии, подтверждение функции гена и разработка быстрого иммунологического анализа закладывают основу для дальнейшего изучения функции и регуляции AoSS, а также дают научную основу для применения протостановых тритерпенов частухи восточной в синтетической биологии.