Простой метод количественной оценки конфокальных флуоресцентных изображений

Вестерн-блоттинг (WB), иммуноферментный анализ (ELISA) и проточная цитометрия (FC) давно применяются для определения и количественной оценки относительной экспрессии белков в культивируемых клетках и образцах тканей. Однако вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ имеют ограниченные возможности для содержательной количественной оценки относительного уровня белка в тканях со сложным клеточным составом, а диссоциация ткани с последующей проточной цитометрией невозможна, если доступное количество ткани ограничено и/или клетки трудно выделить. Хотя выявление белков в тканях с помощью иммуннофлуоресцентных (IF) зондов традиционно считалось качественным методом, достижения в области стабильности зондов и конфокальной визуализации позволяют легко проводить количественную оценку данных иммунофлуоресценции. При этом воспроизводимая количественная оценка относительной экспрессии белка требует тщательного выбора соответствующих контролей, планирования эксперимента и сбора данных. Здесь описаны методы количественной оценки данных, представленных в работе Shihan и соавт., в которой изложен рабочий процесс, позволяющий использовать данные иммунофлуоресценции, полученные на конфокальном микроскопе, для количественной оценки относительного уровня интересующей молекулы по средней интенсивности флуоресценции в пределах области интереса, числу клеток и доле клеток образца, «положительных» по окрашиванию соответствующим флуоресцентным зондом. В статье также рассматриваются особенности получения количественно анализируемых флуоресцентных изображений на конфокальном микроскопе и приводятся подробные методы количественной оценки данных иммунофлуоресценции с использованием FIJI-ImageJ. Shihan, Matrix Biology, 2020