Одноклеточный атлас роговицы человека, определяющий её развитие, лимбальные клетки-предшественники и их взаимодействие с иммунными клетками

Цель: Провести одноклеточный анализ ключевых эмбриональных, внутриутробных и взрослых стадий развития для создания всеобъемлющего одноклеточного атласа всех типов клеток роговицы и прилежащей конъюнктивы — от этапа развития до взрослого состояния.

Методы: Четыре образца роговицы взрослых людей и 17 образцов эмбриональной и внутриутробной роговицы, полученных на сроках 10–21 неделя после зачатия, диссоциировали до отдельных клеток и подвергали одноклеточному секвенированию РНК (scRNA-seq) и/или секвенированию доступности хроматина транспозазой (ATAC-seq) на платформе 10x Genomics. Данные визуализировали с использованием метода равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP), а кластеризацию выполняли на основе графового алгоритма Seurat. Идентификацию кластеров проводили по экспрессии генов-маркеров, результатам биоинформатического анализа и иммуннофлуоресцентного исследования. На культивируемых лимбальных эпителиальных клетках (LEC) выполняли РНК-интерференцию, иммуннофлуоресцентное исследование, оценку эффективности образования колоний и клональный анализ.

Результаты: Одноклеточный анализ РНК 21 343 клеток из четырёх образцов роговицы взрослых людей и прилежащей конъюнктивы выявил 21 клеточный кластер, включавший клетки-предшественники и дифференцированные клетки всех слоёв роговицы и конъюнктивы, а также иммунные клетки, меланоциты, фибробласты, кровеносные и лимфатические сосуды. Был выявлен небольшой клеточный кластер с высокой экспрессией маркеров лимбальных клеток-предшественников (LPC). Псевдовременной анализ показал, что эти клетки дают начало пяти другим типам клеток, соответствующим всем подтипам дифференцированных эпителиальных клеток лимба и роговицы. На основании преимущественной экспрессии в криптах лимба взрослой и развивающейся роговицы, а также подтверждения методом РНК-интерференции на культивируемых LEC был идентифицирован новый предполагаемый поверхностный маркер LPC — GPHA2, экспрессировавшийся на поверхности 0,41% ± 0,21 культивируемых LEC. При объединении результатов одноклеточного секвенирования РНК и ATAC-seq были выявлены многочисленные вышестоящие регуляторы LPC и продемонстрировано тесное взаимодействие иммунных клеток с лимбальными клетками-предшественниками. Анализ РНК показал утрату экспрессии GPHA2 и приобретение маркеров пролиферирующих базальных эпителиальных клеток лимба при экспансии LEC вне организма независимо от использованного метода культивирования. При анализе кератоконуса были выявлены два ключевых изменения, лежащих в основе фенотипа заболевания: активация коллагеназы в строме роговицы и уменьшение пула супрабазальных клеток лимба. Одноклеточное секвенирование РНК 89 897 клеток эмбриональной и внутриутробной роговицы показало, что в процессе развития эпителий конъюнктивы первым дифференцируется из эпителия глазной поверхности, за ним следуют эпителий роговицы и формирование LPC; последние возникают за несколько недель до формирования лимбальной ниши.

Выводы: Данные одноклеточного секвенирования РНК и ATAC-seq развивающейся и взрослой роговицы в стабильном состоянии и при заболевании представляют собой уникальный ресурс для выявления генов и сигнальных путей, которые могут способствовать совершенствованию методов экспансии LPC вне организма, дифференцировки стволовых клеток, а также пониманию и лечению заболеваний глазной поверхности.