Оптимальные методы удаления меланина для окраски гематоксилином и эозином, иммуногистохимического исследования и молекулярной диагностики

Цель: Определить оптимальный метод удаления меланина для окраски гематоксилином и эозином (ГЭ), иммуногистохимического исследования и молекулярной диагностики.

Методы: В исследование включили 38 парафиновых образцов тканей злокачественной меланомы, диагностированной в онкологической больнице Фуцзяни (Фучжоу, Китай) с января 2018 года по март 2022 года; из них изготовили тканевой микромассив. Меланин удаляли одним из четырёх способов: тёплой перекисью водорода, двойным окислительным обесцвечиванием, модифицированным методом с перманганатом калия и щавелевой кислотой или трихлоризоциануровой кислотой, после чего выполняли окраску ГЭ. В одной группе сначала удаляли меланин одним из этих методов, а затем проводили иммуногистохимическое исследование (SOX-10, Ki-67, HMB45 и Melan A); в другой сначала выполняли иммуногистохимическое исследование, а затем удаляли меланин. Кроме того, отобрали 17 парафиновых образцов тканей с высоким содержанием меланина и обработали их теми же способами. После этого выделили ДНК и оценили её количество и качество. Сравнили полноту удаления меланина, влияние на окраску ГЭ и иммуногистохимическое исследование, а также качество ДНК при использовании разных методов обесцвечивания.

Результаты: Наиболее эффективными оказались модифицированный метод с перманганатом калия и щавелевой кислотой и обработка тёплой перекисью водорода: остаточный меланин выявлялся лишь в 5,26% случаев (2/38) при использовании каждого из этих методов. После обработки трихлоризоциануровой кислотой пигмент сохранялся в 10,53% случаев (4/38), а после двойного окислительного обесцвечивания — в 15,79% (6/38). При окраске ГЭ доля препаратов с хорошим качеством окрашивания после обработки тёплой перекисью водорода составила 92,11% — больше, чем при использовании остальных трёх методов. При иммуногистохимическом исследовании средние баллы окрашивания после выполнения иммуногистохимического исследования с последующим удалением меланина модифицированным методом с перманганатом калия и щавелевой кислотой, двойным окислительным обесцвечиванием и трихлоризоциануровой кислотой составили соответственно 20,84, 26,63 и 35,02. Эти показатели были выше, чем при удалении меланина до иммуногистохимического исследования: 8,70, 15,41 и 21,22 соответственно. Средний балл окрашивания после удаления меланина тёплой перекисью водорода с последующим иммуногистохимическим исследованием составил 33,57, что выше, чем при обратном порядке процедур (19,96). При иммуногистохимическом исследовании с последующим удалением меланина трихлоризоциануровой кислотой баллы окрашивания HMB45, Melan A и Ki-67 составили соответственно 36,45, 33,79 и 36,24; для SOX-10 наилучший результат (34,39) был получен при удалении меланина тёплой перекисью водорода с последующим иммуногистохимическим исследованием. Модифицированный метод с перманганатом калия и щавелевой кислотой, двойное окислительное обесцвечивание и трихлоризоциануровая кислота вызывали значительную деградацию ДНК. Средняя концентрация ДНК после удаления меланина перекисью водорода составила 59,59 мкг/л — значительно больше, чем без удаления меланина (30,3 мкг/л; p=0,001). Во всех образцах после обработки перекисью водорода отношение A260/A280 составляло 1,8–2,0; в 16 образцах отношение A260/A230 было выше 2,0, что свидетельствует о высокой чистоте ДНК. В образцах без удаления меланина чистота ДНК была ниже: отношение A260/A280 было менее 1,8 в восьми образцах, а A260/A230 — менее 2,0 в 16 образцах.

Выводы: По сравнению с тремя другими методами тёплая перекись водорода обеспечивала наименьшее количество остаточного меланина, лучшее качество окраски ГЭ и минимально влияла на чистоту и качество ДНК. Поэтому этот метод наиболее подходит для ПЦР, секвенирования нового поколения и других методов молекулярной диагностики. Удаление меланина трихлоризоциануровой кислотой после иммуногистохимического исследования оставляло меньше всего пигмента и могло быть наиболее удобным и эффективным. Однако результат одного и того же метода обесцвечивания зависит от используемых антител, поэтому метод следует выбирать с учётом исследуемых маркеров.