Методы высокопроизводительного секвенирования для выявления двух вирусов земляники в условиях поствъездного карантина

Технологии высокопроизводительного секвенирования могут быть полезны для проверки импортируемого растительного генетического материала на наличие нескольких патогенов в одном образце и позволяют выявлять их независимо от штамма, чего не обеспечивают большинство методов на основе ПЦР. Метатранскриптомный анализ (RNAseq) и ПЦР с перекрывающимися ампликонами (TA-PCR) оценивали как методы высокопроизводительного секвенирования для выявления вирусов при низком титре. Для сопоставления RNAseq и TA-PCR с количественной ПЦР выбрали вирус крапчатости земляники (SMoV), РНК-содержащий вирус, и вирус полосатости жилок земляники (SVBV), ДНК-содержащий вирус. Для получения наборов данных, включавших от 3 до 120 млн парных прочтений, методом RNAseq анализировали образцы с низким титром вируса после удаления рибосомной РНК растений. При получении 60 млн парных прочтений чувствительность RNAseq была сопоставима с чувствительностью ПЦР: метод выявлял всего 10 копий вируса/мкл. Специально разработанные для каждого вируса панели праймеров TA-PCR позволили восстановить большую часть референсного генома каждого вируса. TA-PCR с одной и несколькими мишенями позволяла выявлять вирусы в образцах с концентрацией около 10 копий/мкл; минимальная длина восстановленного непрерывного участка последовательности составляла 500 п.н. Предел обнаружения описанных методов на основе высокопроизводительного секвенирования сопоставим с пределом обнаружения количественной ПЦР. Эта работа создает основу для более гибкого применения высокопроизводительного секвенирования при выявлении вирусов растений.