Проточно-цитометрический анализ связывания флуоресцеин-конъюгированного эстрадиола (E-BSA-FITC) в суспензиях клеток рака молочной железы

По мере расширения применения гистохимических методов выявления связывания эстрогенов (рецепторов эстрогенов, РЭ) в опухолевых клетках возрастает потребность в объективном количественном определении флуоресцентно окрашенных клеток. В этом исследовании с помощью проточной цитометрии изучали специфичность и кинетику связывания 17β-эстрадиол-6-CMO-BSA-FITC (E-BSA-FITC) в двух линиях клеток рака молочной железы человека — MCF-7 и 47-DN. Клетки делали проницаемыми для этого лиганда методом замораживания-оттаивания, аналогичным стандартному окрашиванию замороженных срезов опухоли E-BSA-FITC для клинического выявления РЭ. Количественная оценка интенсивности связывания E-BSA-FITC методом проточной цитометрии показала насыщаемую зависимость «доза—ответ»; связывание специфически снижалось в присутствии диэтилстильбэстрола (ДЭС) в концентрациях, известных своей способностью насыщать рецепторы эстрогенов I типа. Анализ по Скэтчарду указывает на связывание E-BSA-FITC с рецепторами, обладающими различным сродством (Kd). Графики Лайнуивера—Берка показали, что ДЭС конкурентно ингибирует связывание E-BSA-FITC с рецептором высокого сродства, Kd которого составляет приблизительно 50 нМ. В работе также сопоставляли количественную оценку РЭ методами проточной цитометрии и биохимического анализа в двух условиях роста опухолевых клеток, которые могут встречаться в клинических образцах: в состоянии покоя и при активной пролиферации, а также после предварительной обработки антиэстрогеном тамоксифеном. По данным проточной цитометрии, в клетках с более высокой пролиферативной активностью количество специфически связанного E-BSA-FITC было в 10 раз выше, а предварительная обработка тамоксифеном снижала специфическое связывание на 50%. Результаты проточной цитометрии хорошо согласовывались с данными биохимического анализа и указывают на то, что этот новый метод может дополнять выявление связывания E-BSA-FITC методом флуоресцентной микроскопии.