Локальное оптическое исследование белков различного размера и заряда с помощью метки FITC

Флуоресцеиновые красители широко применяют во флуоресцентной биоимиджинг-визуализации для определения пространственного распределения субструктур или мониторинга кинетики определённых процессов в клетках. Однако оптические свойства этих красителей чувствительны к ряду физических и химических параметров микроокружения, а при конъюгации с макромолекулой краситель может дополнительно служить индикатором таких параметров в приповерхностных областях. Цель настоящего исследования — выявить взаимосвязь между реакцией флуоресцеинового зонда и структурой макромолекулы, с которой он связан. Мы конъюгировали флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC) с четырьмя белками различного размера и поверхностного заряда: лизоцимом из куриного яичного белка, бычьей карбоангидразой II, бычьим сывороточным альбумином и люциферазой Photobacterium leiognathi. Затем проанализировали взаимосвязь спектральных, временных и поляризационных характеристик флуоресцентного зонда с параметрами размера и заряда белков. Показано, что при pH 6,50 ионное равновесие FITC и диэлектрическая проницаемость (ε) вблизи поверхности белка отличаются от соответствующих показателей в объёмной фазе. Впервые выявлены сильная отрицательная корреляция между локальной ε и площадью гидрофобной поверхности белка, а также сильная положительная корреляция между плотностью суммарного заряда белка и ратиометрическим флуоресцентным сигналом FITC (I/I). Установлено, что совокупное влияние ковалентного и электростатического связывания FITC с белком повышает жёсткость конъюгации, что позволяет адекватно оценивать размер белка методом деполяризации флуоресценции.488435