Усовершенствованные методы patch-clamp для регистрации токов с высоким разрешением в клетках и бесклеточных мембранных участках

1. Метод внеклеточной регистрации patch-clamp, впервые позволивший обнаруживать токи одиночных каналов в биологических мембранах, был усовершенствован для повышения разрешения по току, прямого контроля потенциала мембранного участка и его физического отделения. 2. Описан удобный способ изготовления регистрирующих пипеток для patch-clamp и приведены процедуры формирования гигаомных контактов — уплотнений между пипеткой и мембраной с сопротивлением 10⁹–10¹¹ Ом. 3. Описаны базовая схема регистрации patch-clamp и способы улучшения частотной характеристики, а также существующие ограничения при регистрации токов одиночных каналов. 4. Приведены процедуры подготовки и регистрации сигналов от трёх типичных типов клеток. Для демонстрации улучшенного разрешения по току и времени, достигаемого при гигаомных контактах, описаны некоторые свойства одиночных каналов мышечной мембраны, активируемых ацетилхолином. 5. Описаны различные способы физического отделения мембранных участков от клеток. Это позволяет регистрировать токи одиночных каналов при точно заданном составе растворов по обе стороны мембраны. Можно сформировать два типа изолированных бесклеточных патчей: патч «изнутри наружу», при котором цитоплазматическая поверхность мембраны обращена к раствору в камере, и патч «снаружи наружу», при котором к раствору в камере обращена внеклеточная поверхность мембраны. 6. Рассмотрено применение метода для регистрации ионных токов и внутриклеточного диализа небольших клеток. При регистрации от целой клетки разрешение на уровне одиночных каналов достижимо, если диаметр клетки мал (менее 20 мкм). 7. Обсуждается широкий спектр типов клеток, на которых можно сформировать гигаомные контакты.