Выявление мРНК в эмбрионах морского ежа методом гибридизации in situ с использованием асимметричных РНК-зондов

Асимметричные РНК-зонды, содержащие только одну цепь, предназначенную для гибридизации с мРНК, обеспечивают значительно более высокую эффективность гибридизации in situ, чем симметричные РНК-зонды, включающие обе цепи, или ДНК-зонды. Такие зонды синтезируют in vitro методом транскрипции рекомбинантных конструкций, полученных из последовательностей, кодирующих мРНК морского ежа, и вектора транскрипции R7 delta 7. С помощью зонда, соответствующего последовательностям мРНК ранних вариантов гистонов, охарактеризовали гибридизацию срезов эмбрионов морского ежа: оценили термическую стабильность образующихся гибридов, оптимальную температуру, влияние расхождения последовательностей на термическую стабильность гибридов, а также зависимость сигналов гибридизации от концентрации зонда и продолжительности гибридизации. По интенсивности сигналов оценили, что значительная доля целевых РНК сохраняется в срезах и при насыщении гибридизуется с зондом. С учётом измерений неспецифического связывания гетерологичных зондов эти данные свидетельствуют, что метод достаточно чувствителен для выявления многих мРНК средней представленности — 20–75 молекул на клетку у плутеуса, состоящего из 1500 клеток. Гибридизация in situ эмбрионов на разных стадиях развития показала, что в дробящихся эмбрионах мРНК гистонов распределены равномерно, тогда как в более поздних эмбрионах их накопление значительно различается в разных клеточных линиях.