Единый протокол выявления транскриптов разных типов и уровней экспрессии в нервной ткани и культивируемых клетках: гибридизация in situ с зондами на основе кРНК, меченной дигоксигенином

Разработан простой метод гибридизации in situ без использования радиоактивных меток для срезов ткани и культивируемых клеток с применением зондов на основе кРНК, меченной дигоксигенином. Протокол позволяет выявлять различные транскрипты с широким диапазоном уровней экспрессии в центральной нервной системе. В качестве примеров представлены сигналы гибридизации в мозжечке для транскриптов с предположительно высоким (основной белок миелина, MBP), умеренным (GluR1 — субъединица рецепторов глутамата, чувствительных к АМРА и каинату) и низким (инозитолполифосфат-5-фосфатаза) уровнем экспрессии. Исключение обработки этанолом, обычно применяемой в других методах, существенно повысило чувствительность и клеточное разрешение. Локализацию меченой клетки относительно её окружения легче оценить при контрастном окрашивании ткани ядерным красителем Hoechst 33258. Как показано на примере глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), этот протокол можно сочетать с иммуноцитохимией. Подробно описаны все этапы метода: приготовление и мечение зондов на основе кРНК, предварительная обработка ткани, гибридизация и визуализация меченых транскриптов.