Оптимизация выживаемости гиппокампальных нейронов в среде Neurobasal с добавкой B27: новая комбинация бессыворочной среды

Мы систематически оптимизировали концентрации 20 компонентов ранее описанной бессывороточной среды (Brewer and Cotman, Brain Res 494: 65–74, 1989), оценивая выживаемость нейронов гиппокампа эмбриональных крыс после 4 дней культивирования. Добавка B27 к бессывороточной среде обеспечивала выживаемость нейронов более 60% при плотности посева свыше 160 клеток/мм² независимо от плотности. При культивировании изолированных клеток (<100 клеток/мм²) выживаемость через 4 дня превышала 45%; при плотности 40 клеток/мм² её можно было повысить до 60%, просто накрыв клетки покровным стеклом. Это указывает на потребность в дополнительных трофических факторах. Высокая выживаемость достигалась при осмолярности ниже, чем у среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), за счёт снижения концентраций цистеина и глутамина и удаления токсичного сульфата железа, содержащегося в среде DME/F12. Neurobasal — новая среда, в которой реализованы эти изменения состава DMEM. В среде B27/Neurobasal рост глии ограничивался: доля глиальных клеток в почти чистой нейрональной популяции составляла менее 0,5% по данным иммуноцитохимического окрашивания на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и нейронспецифическую энолазу (NSE). Через 4 недели культивирования сохранялась высокая жизнеспособность: более 90% при плотности посева 640 клеток/мм² и более 50% при плотности 160 клеток/мм². Поскольку среда также поддерживает рост нейронов из полосатого тела, чёрной субстанции, перегородки и коры эмбриональных крыс, а также зубчатой извилины и мозжечка новорождённых крыс (Brewer, готовится к публикации), вероятно, она подходит и для других типов нейронов. Среда B27/Neurobasal может быть полезна для исследований нейротоксичности, фармакологии, электрофизиологии, экспрессии генов, развития нейронов, а также влияния факторов роста и гормонов in vitro.