Морфологические критерии и выявление апоптоза

Апоптоз представляет собой организованный энергозависимый процесс, приводящий к гибели клетки. Его определение основано на характерных морфологических признаках [10] и выявлении межнуклеосомной деградации ДНК [27], осуществляемой избирательно активируемыми ДНКазами [4, 22]. К морфологическим признакам апоптоза относятся маргинация хроматина, конденсация и фрагментация ядра, а также уплотнение клетки при сохранении органелл. Затем клетка фрагментируется с образованием окружённых мембраной апоптотических телец, которые фагоцитируются соседними клетками без развития воспаления [10, 11]. Апоптоз обычно возникает в отдельных изолированных клетках. Продолжительность апоптоза оценивают в 12–24 часа, однако в культуре клеток видимые морфологические изменения формируются менее чем за два часа [10, 16].

Неапоптотическая гибель клеток, прототипом которой служит гибель вследствие ишемии (онкоз), характеризуется истощением внутриклеточных запасов АТФ, набуханием клетки с повреждением органелл и разрывом плазматической мембраны [15]. В тканях обнаруживаются группы некротических клеток и воспаление [10, 15].

Значение апоптоза преимущественно изучали с помощью TUNEL-теста, выявляющего разрывы цепей ДНК в срезах тканей и позволяющего количественно оценивать число апоптотических клеток при световой микроскопии [6]. По общему опыту, TUNEL-тест склонен давать ложноотрицательные и ложноположительные результаты. Это объясняют зависимостью кинетики окрашивания от концентрации реагента [17], фиксации ткани [2] и степени протеолиза [17]. Активный синтез РНК [12] и повреждение ДНК в некротических клетках [17, 19] могут обусловливать неспецифическое окрашивание.

Для получения надёжных и воспроизводимых результатов TUNEL-тест необходимо тщательно стандартизировать, используя срезы тканей, обработанные ДНКазой (положительный контроль апоптоза). Количественная оценка апоптоза должна включать достаточное число полей зрения и идентификацию типа клеток, подвергающихся апоптозу. Специфичность результатов можно подтвердить сочетанием TUNEL-теста с другими методами, например оценкой характера фрагментации ДНК или морфологических признаков.

Несмотря на значительную вариабельность результатов последовательных исследований, проведённых в одинаковых условиях, всё больше данных свидетельствует о том, что TUNEL-положительные кардиомиоциты и межнуклеосомная фрагментация ДНК связаны с различными заболеваниями сердца, включая острый инфаркт миокарда и сердечную недостаточность [обзор см. в 5, 9]. Некоторые морфологические признаки апоптоза наблюдали в TUNEL-положительных кардиомиоцитах при световой микроскопии (рис. 1) или конфокальной микроскопии [20]. Электронно-микроскопические признаки апоптоза выявлены в дегенерирующей проводящей системе [7], при экспериментальной сердечной недостаточности [23] и в гибернирующем миокарде человека [3].

При острой ишемии миокарда интерпретация результатов остаётся спорной, поскольку при электронной микроскопии обнаруживали только морфологические признаки неапоптотической гибели клеток [8, 19]. Одно из объяснений может заключаться в прерывании апоптотической программы вследствие дефицита АТФ до того, как морфологические признаки успевают полностью сформироваться [14]. Другое объяснение — возможность наличия общих механизмов неапоптотической гибели клеток и апоптоза на ранних этапах этих процессов [14, 19]. Точные механизмы ишемической гибели клеток ещё предстоит установить, а классификацию гибели клеток как апоптотической или неапоптотической — уточнить.

В последнее время активация каспаз стала рассматриваться как центральное молекулярное событие, приводящее к апоптозу и предшествующее деградации ДНК и развитию апоптотических морфологических изменений [22, 25]. Разработаны новые методы выявления активации каспаз [1, 13]. Ингибирование каспаз может стать эффективным способом предотвращения апоптотической гибели кардиомиоцитов, а также определения и целенаправленного изучения значения апоптотической гибели клеток при заболеваниях сердца.