Определение бактериальной нагрузки методом ПЦР в реальном времени с использованием универсального зонда и набора праймеров

Представлены разработка и оценка универсального набора праймеров и зонда для амплификации 16S рДНК бактерий с целью определения общей бактериальной нагрузки методом ПЦР в реальном времени. Широкая специфичность универсальной системы выявления подтверждена при исследовании ДНК, выделенной из 34 видов бактерий, представляющих большинство групп бактерий, описанных в «Определителе бактерий» Берджи. Однако решающее значение имел характер хромосомной ДНК, использованной в качестве стандарта. Для более точного определения общей бактериальной нагрузки важно, чтобы стандарт ДНК представлял бактерии, наиболее вероятно преобладающие в конкретной среде, поскольку число копий 16S рДНК варьирует, а скорость роста бактерий влияет на это число: при быстром росте могут формироваться множественные репликационные вилки, вследствие чего отдельные участки хромосомы фактически представлены более чем одной копией. Обоснованность учёта этих факторов при оценке бактериальной нагрузки подтверждена подсчётом числа бактерий в искусственном образце, приготовленном in vitro, и в клинических образцах кариозного дентина. С учётом указанных параметров число анаэробных бактерий в кариозном дентине, определённое с помощью универсального набора зонда и праймеров, оказалось в 40 раз выше общей бактериальной нагрузки, выявленной культуральными методами, что продемонстрировало пригодность ПЦР в реальном времени для анализа этой среды.