Анализ количественных данных полимеразной цепной реакции в реальном времени без предварительных допущений

Количественное определение мРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с мониторингом образования продукта с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I широко применяется в нейронауках, биологии развития и медицинской диагностике. В большинстве методов анализа данных ПЦР предполагается, что эффективность реакции для исследуемого ампликона постоянна или, как в случае сравнительного метода C(t), равна 2. Последний метод уже приводит к четырёхкратной ошибке, если эффективность ПЦР изменяется всего в диапазоне 0,04. Эффективность ПЦР для ампликонов обычно рассчитывают по стандартным кривым, построенным либо на основе известных количеств РНК, либо по серии разведений образца референсной кДНК. В настоящей работе показано, что первый подход может приводить к изменению эффективности ПЦР в диапазоне 0,2, тогда как при втором подходе ошибка может составлять 0,26. Поэтому мы предлагаем линейную регрессию данных о логарифме флуоресценции в зависимости от номера цикла как метод, не требующий предварительных допущений, для расчёта исходных концентраций мРНК и эффективности ПЦР в каждом образце. Компьютерную программу для выполнения этих расчётов можно получить по запросу (электронная почта: bioinfo@amc.uva.nl; тема письма: LinRegPCR).