Оптимизированный метод выделения РНК из тканей винограда и статистическая оценка референсных генов для ОТ-ПЦР в реальном времени в ходе развития ягод

Введение: Точность количественной ОТ-ПЦР в реальном времени зависит от высокого качества РНК, воспроизводимости синтеза кДНК и использования валидированных стабильных референсных генов для нормализации данных. Выбор референсных генов влияет на результаты исследований экспрессии, поэтому их необходимо оценивать перед применением для разных образцов и условий воздействия. Для винограда статистически валидированных референсных генов описано немного. Кроме того, выделению высококачественной РНК из тканей винограда обычно мешают низкий pH, высокое содержание полифенолов и полисахаридов.

Результаты: Мы оптимизировали метод выделения РНК, компенсирующий низкий pH ягод винограда и облегчающий осаждение РНК. Метод проверили на сериях образцов околоплодника и семян на разных стадиях развития, а также на тканях листьев, корней и цветков в стабильном состоянии. Кроме того, тремя статистическими методами оценили стабильность экспрессии генов actin, AP47 (белок, ассоциированный с клатрином), cyclophilin, EF1-alpha (фактор элонгации 1-альфа), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), MDH (малатдегидрогеназа), PP2A (протеинфосфатаза), SAND, TIP41, alpha-tubulin, beta-tubulin, UBC (фермент конъюгации убиквитина), UBQ-L40 (убиквитин L40) и UBQ10 (полиубиквитин) в околоплоднике Vitis vinifera сорта Cabernet Sauvignon. Несколько генов показали относительно стабильную экспрессию, однако ни один из них не превосходил остальные по всем трём методам оценки. Также показано, как выбор одного референсного гена вместо нормализации по геометрическому среднему нескольких генов влияет на оценку экспрессии аквапорина и переносчика сахарозы в ходе развития ягод.

Выводы: Для точного определения относительного уровня транскриптов методом ОТ-ПЦР в реальном времени при изучении развития ягод винограда рекомендуется нормализовать данные по сочетанию нескольких генов. Наиболее подходящими референсными генами для этой цели оказались GAPDH, actin, EF1-alpha и SAND.