Оптимизация анализа В-лимфоцитарного ELISpot у человека по IgG для оценки В-клеточного ответа, индуцированного вакцинацией

В-клеточный ответ после инфекции или вакцинации часто оценивают по титрам антиген-специфических антител в сыворотке. Однако такой подход не отражает активность В-клеток памяти и потому не дает полной картины В-клеточного ответа. Поэтому анализ В-клеток памяти с помощью ELISpot является важным дополнением к традиционной серологии. Метод В-клеточного ELISpot был разработан более 25 лет назад, и многие протоколы и реагенты для него нуждаются в оптимизации. В связи с этим мы поставили цель разработать оптимизированный В-клеточный ELISpot для анализа В-клеток памяти человека, секретирующих IgG, после вакцинации. Был разработан протокол на основе новых моноклональных антител к человеческому IgG и биотин-авидинового усиления сигнала для повышения чувствительности. После сравнения различных соединений, обычно используемых для активации В-клеток памяти in vitro при анализе ELISpot, в качестве наиболее эффективной комбинации активаторов был выбран агонист TLR R848 в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2). Затем новый протокол сравнили с уже существующим протоколом, ранее применявшимся в вакцинных исследованиях, основанным на поликлональных антителах без биотин-авидинового усиления и на активации В-клеток памяти смесью антигена, CpG, IL-2 и IL-10. Новый протокол обеспечивал значительно лучшую чувствительность выявления, сокращал время инкубации, необходимое для активации В-клеток памяти, и уменьшал количество антигена, требуемое для анализа. Работоспособность нового протокола подтвердили при анализе специфических В-клеток памяти к пяти различным антигенам, индуцированным у ограниченного числа испытуемых, вакцинированных против столбняка, дифтерии и коклюша. Небольшое число испытуемых не позволило провести прямое сравнение с другими вакцинными исследованиями. Оптимизация В-клеточного ELISpot облегчит более точный анализ В-клеток, секретирующих IgG, в вакцинных исследованиях.