Оценка термочувствительного каркаса из поли(ε-капролактона) для дифференцировки стволовых клеток in vitro в трёхмерной культуре

Стратегии тканевой инженерии направлены на имитацию естественного процесса регенерации с помощью биорезорбируемых каркасов, поддерживающих прикрепление, миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток. На основе сочетания полностью разлагаемого полимера — поли(ε-капролактона) — с термочувствительным полимером — метакрилатом полиэтиленгликоля — был разработан каркас, который разжижается при температуре ниже 20 °C и затвердевает при 37 °C. В настоящем исследовании оценивали способность этого каркаса поддерживать клетки C2C12 и стволовые клетки, выделенные из жировой ткани человека (ASCs), для формирования объёмной трёхмерной конструкции, пригодной для тканевой инженерии мягких тканей или костной ткани. На первом этапе оптимизировали засев биоматериала и оценивали прикрепление, выживаемость, распределение и сохранность клеток в трёхмерном материале. Клетки C2C12 дифференцировали в остеогенном и миогенном направлениях, а ASCs культивировали в контрольной, адипогенной или остеогенной среде. Дифференцировку оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени для определения экспрессии остеогенных, миогенных и адипогенных маркеров, а также по активности ферментов и результатам иммуноанализов. Оба типа клеток прикреплялись к материалу и равномерно распределялись в нём. В условиях двумерной культуры клетки C2C12 и ASCs обладали потенциалом дифференцировки во всех исследованных направлениях. В условиях трёхмерной остеогенной дифференцировки клеток C2C12 по сравнению с контрольными клетками увеличивались только экспрессия остеокальцина (кратность повышения 16,3 ± 0,2) и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (p < 0,001). Трёхмерная остеогенная дифференцировка ASCs была ограниченной и зависела от донора. Только у одного донора отмечалось повышение уровня остеогенных маркеров — остеокальцина (p = 0,027) и остеопонтина (p = 0,038). Напротив, при дифференцировке в миогенном или адипогенном направлении в трёхмерной культуре выявлялась экспрессия специфических маркеров, как минимум на уровне двумерной культуры. В трёхмерной культуре у клеток C2C12 отмечалось значительное повышение экспрессии миогенина (p < 0,001) и MyoD (p < 0,001). При адипогенной дифференцировке клеток одного донора в трёхмерной культуре по сравнению с двумерной повышалась экспрессия рецептора гамма, активируемого пролифераторами пероксисом (PPARγ) (p = 0,004), белка 4, связывающего жирные кислоты (FABP4) (p = 0,008), и адипонектина (p = 0,045). У обоих доноров уровни лептина в супернатанте культур ASCs были выше в трёхмерных культурах на 14-е и 21-е сутки. Таким образом, термочувствительный каркас оказался пригодным для трёхмерной дифференцировки in vitro в направлении формирования мягких тканей.