Синтез золотых нанокластеров с использованием белка, конъюгированного с флуоресцеин-5-изотиоцианатом, для флуоресцентного ратиометрического определения в фермент-субстратной системе

Описан синтез двухэмиссионного зонда для флуоресцентного ратиометрического определения перекиси водорода (H2O2), активности ферментов и изменений pH среды. Флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC), испускающий зелёную флуоресценцию, конъюгировали с аминогруппами бычьего сывороточного альбумина (BSA). Полученный конъюгат FITC с BSA использовали в качестве матрицы для синтеза золотых нанокластеров (AuNCs), испускающих красную флуоресценцию, в щелочной среде. При возбуждении светом одной длины волны стабилизированные FITC/BSA нанокластеры золота (FITC/BSA-AuNCs) испускали флуоресценцию на длинах волн 525 и 670 нм; интенсивность этих сигналов зависела соответственно от pH раствора и концентрации H2O2. Эффективное тушение флуоресценции AuNCs под действием H2O2 позволяло с помощью FITC/BSA-AuNCs ратиометрически определять активность ферментных систем, образующих H2O2, и их ингибирование, включая окисление глюкозы под действием глюкозооксидазы, гидролиз и окисление ацетилхолина при участии ацетилхолинэстеразы и холиноксидазы, а также вызванное параоксоном ингибирование активности ацетилхолинэстеразы. При использовании pH-нечувствительных AuNCs в качестве внутреннего стандарта FITC/BSA-AuNCs обеспечивали чувствительное и обратимое ратиометрическое определение изменения pH на 0,1 единицы в диапазоне 5,0–8,5. Изменение флуоресценции FITC под действием pH позволяло с помощью FITC/BSA-AuNCs определять активность ферментной системы, образующей аммиак. Это было продемонстрировано на примере определения мочевины в плазме после её гидролиза уреазой.