Праймеры, конвейеры, параметры: проблемы секвенирования гена 16S рРНК

Секвенирование коротких ампликонов гена 16S рРНК в настоящее время является методом выбора при исследовании микробиома. Однако сравнительных исследований различий между используемыми методиками мало. Мы провели секвенирование образцов человеческого кала и модельных микробных сообществ с постепенно увеличивающейся сложностью, используя различные распространённые протоколы. Для оценки влияния выбора праймеров на состав получаемого микробного сообщества исследовали короткие ампликоны, нацеленные на различные вариабельные участки (V-регионы) или их сочетания (V1–V2, V1–V3, V3–V4, V4, V4–V5, V6–V8 и V7–V9). Кроме того, изучали влияние кластеризации — операционных таксономических единиц (OTU), OTU нулевого радиуса (zOTU) и вариантов ампликонных последовательностей (ASV), — различных баз данных (GreenGenes, Ribosomal Database Project, Silva, genomic-based 16S rRNA Database и The All-Species Living Tree), а также настроек биоинформатического анализа на таксономическую классификацию. Мы представляем систематическое сравнение всех обычно используемых V-регионов с применением хорошо охарактеризованных праймеров. Хотя известно, что выбор праймеров существенно влияет на получаемый состав микробиоты, мы показываем, что профили микробиома, сформированные с использованием разных пар праймеров, требуют независимой валидации эффективности. Кроме того, сопоставление наборов данных для разных V-регионов при использовании различных баз данных может вводить в заблуждение из-за различий в номенклатуре (например, Enterorhabdus и Adlercreutzia) и неодинаковой точности классификации вплоть до уровня рода. В целом отдельные, но важные таксоны не выявляются при использовании определённых пар праймеров (например, Acetatifactor не определяется при использовании праймеров 515F–944R) или вследствие выбора базы данных (например, Bacteroidetes отсутствует в GreenGenes и genomic-based 16S rRNA Database). Мы установили, что корректное усечение ампликонов имеет принципиальное значение, а для каждого исследования необходимо тестировать различные сочетания длины усечения. Наконец, настоятельно рекомендуется использовать специфические модельные микробные сообщества достаточной и адекватной сложности.

Значимость: При секвенировании гена 16S рРНК некоторые роды бактерий оказываются недопредставленными или полностью отсутствуют в таксономических профилях при использовании неподходящих сочетаний праймеров, устаревших референсных баз данных или некорректных настроек аналитического конвейера. В последнем случае различия между исследованиями обусловлены, в частности, порогами качества и настройками биоинформатического анализа — подходом к кластеризации, аналитическим конвейером и отдельными параметрами, например усечением последовательностей. Сопоставление одного набора данных с другим, например данных разных публикаций, представляется проблематичным и требует независимой перекрёстной валидации с использованием одинаковых V-регионов и унифицированной обработки данных. Поэтому при планировании исследования необходимо тщательно выбирать V-регион с учётом исследуемого материала и использовать достаточно сложные модельные стандарты. Выбранные конвейеры обработки и их параметры следует предварительно тестировать.