Сочетание частухи и атрактилодеса уменьшает повреждение головного мозга при ишемии/реперфузии, подавляя астроцитарные экзосомальные miR-200a-3p/141-3p, нацеленные на SIRT1

Этнофармакологическая значимость: Сочетание частухи и атрактилодеса (AA) — классический отвар из традиционной китайской медицины, который может защищать от повреждения головного мозга при ишемии/реперфузии (CIRI). Однако лежащий в основе этого эффекта механизм не изучен. Известно, что экзосомальные микроРНК (miRNA) играют важную роль в фармакологическом действии отваров китайских трав.

Цель исследования: Оценить, зависит ли нейропротективное действие AA от эффективного переноса miRNA с помощью экзосом в головном мозге.

Материалы и методы: У мышей C57BL/6 вызывали преходящую глобальную ишемию/реперфузию головного мозга (GCI/R) перевязкой обеих общих сонных артерий (BCAL); животным вводили AA или не вводили его. Неврологические нарушения оценивали по модифицированной шкале тяжести неврологического дефицита (mNSS) и в водном лабиринте Морриса (MWM). Экспрессию сиртуина 1 (SIRT1) в коре головного мозга определяли методом иммуноблоттинга. Выраженность воспаления количественно оценивали по экспрессии фосфорилированного ядерного фактора κB (p-NF-κB), интерлейкина-1β (IL-1β) и фактора некроза опухоли α (TNF-α), используя иммуноблоттинг, а также по результатам иммуногистохимического окрашивания на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP). Для оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) методом иммуногистохимического окрашивания исследовали экспрессию белков zonula occludens-1 (ZO-1), окклюдина, клаудина-5 и CD31. Экзосомы выделяли из межклеточного пространства головного мозга ультрацентрифугированием и идентифицировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, иммуноблоттинга и анализа траекторий наночастиц. Происхождение экзосом устанавливали, определяя специфические мРНК в экзосомах методом количественной ПЦР в реальном времени после обратной транскрипции. Дифференциально экспрессируемые miRNA в экзосомах выявляли с помощью микрочипового анализа и подтверждали методом количественной ПЦР в реальном времени. Экзосомы метили флуоресцентным красителем PKH26 и инкубировали с клетками bEnd.3. В надосадочной жидкости определяли содержание IL-1β и TNF-α методом иммуноферментного анализа, а в клетках после выделения общей РНК оценивали экспрессию miR-200a-3p/141-3p методом количественной ПЦР в реальном времени. Кроме того, измеряли уровни miR-200a-3p/141-3p в клетках bEnd.3 после кислородно-глюкозной депривации/реоксигенации (OGD/R). Прямое взаимодействие miR-200a-3p/141-3p с 3'-нетранслируемой областью (3'UTR) SIRT1 оценивали по изменению экспрессии SIRT1 в клетках bEnd.3, трансфицированных миметиком или ингибитором miR-200a-3p/141-3p.

Результаты: AA значительно уменьшало выраженные неврологические нарушения и потерю памяти, вызванные GCI/R у мышей; наиболее выраженный эффект наблюдался при средней дозе. У мышей с GCI/R, получавших AA, по сравнению с животными без лечения повышалась экспрессия SIRT1, ZO-1, окклюдина, клаудина-5 и CD31 и снижалась экспрессия p-NF-κB, IL-1β, TNF-α и GFAP. Кроме того, в астроцитарных экзосомах мышей с GCI/R выявлялось повышенное содержание miR-200a-3p/141-3p, которое снижалось при введении AA в средней дозе. Экзосомы переносили miR-200a-3p/141-3p в клетки bEnd.3, усиливали высвобождение IL-1β и TNF-α и снижали экспрессию SIRT1. В клетках bEnd.3 после OGD/R значимых изменений уровней miR-200a-3p/141-3p не выявлено. Миметик miR-200a-3p/141-3p снижал экспрессию SIRT1 в клетках bEnd.3, а ингибитор — повышал.

Выводы: Полученные данные свидетельствуют, что AA ослабляет воспалительное повреждение головного мозга при ишемии/реперфузии, подавляя астроцитарные экзосомальные miR-200a-3p/141-3p, нацеленные на ген SIRT1. Результаты дополняют доказательную базу нейропротективного действия AA и указывают на новый регуляторный механизм этого эффекта.