Абсолютное количественное определение мРНК с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — наиболее чувствительный метод выявления низких концентраций мРНК, часто применяемый при работе с небольшими образцами тканей. Однако этот метод сложен, а его фактическая чувствительность, воспроизводимость и специфичность сопряжены со значительными проблемами; кроме того, как количественный метод ОТ-ПЦР имеет ограничения, свойственные ПЦР. Появление флуоресцентных методов кинетической ОТ-ПЦР значительно упростило воспроизводимое количественное определение мРНК и позволило рассчитывать на преодоление этих ограничений. Тем не менее успешное применение таких методов требует чёткого понимания практических проблем: для точного количественного измерения транскрипции необходимы тщательное планирование и проведение эксперимента, а также валидация метода. В этом обзоре рассматриваются технические аспекты, сопоставляются традиционные и кинетические методы ОТ-ПЦР для количественной оценки экспрессии генов и сравниваются различные системы кинетической ОТ-ПЦР. Возможности этих методов иллюстрируются значительными различиями в уровнях транскрипции гена домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) у разных людей.