Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход

Значительное количество времени и усилий можно сэкономить, одновременно амплифицируя несколько последовательностей в одной реакции; этот процесс называют мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для мультиплексной ПЦР необходимо, чтобы праймеры обеспечивали амплификацию уникальных участков ДНК как в отдельных парах, так и в сочетании многих праймеров, при одном наборе условий реакции. Кроме того, должны быть доступны методы анализа каждого отдельного продукта амплификации из смеси всех продуктов. Мультиплексная ПЦР становится быстрым и удобным скрининговым методом как в клинической, так и в исследовательской лаборатории. Разработка эффективной мультиплексной ПЦР обычно требует стратегического планирования и многократных попыток оптимизации условий реакции. Для успешного анализа важны относительная концентрация праймеров, концентрация буфера для ПЦР, соотношение хлорида магния и дезоксинуклеотидов, температура циклов, а также количество матричной ДНК и ДНК-полимеразы Taq. Оптимальное сочетание температуры отжига и концентрации буфера необходимо для получения высокоспецифичных продуктов амплификации. Концентрация хлорида магния должна быть лишь пропорциональна количеству дНТФ, при этом корректировка концентрации праймеров для каждой мишени также имеет принципиальное значение. Перечень факторов, которые могут влиять на реакцию, далеко не исчерпывающий. Оптимизация параметров, обсуждаемых в настоящем обзоре, должна обеспечить практический подход к решению распространённых проблем мультиплексной ПЦР, таких как неспецифические продукты амплификации, неравномерная амплификация или отсутствие амплификации некоторых мишеней, а также трудности воспроизведения отдельных результатов. Тщательная оценка и валидация новых методов мультиплексной ПЦР обязательны. Чувствительность и специфичность необходимо всесторонне оценивать с использованием стандартизованных очищенных нуклеиновых кислот. При наличии следует максимально использовать внешние и внутренние контроли качества, которые должны применяться строго. По мере увеличения числа микробных агентов, выявляемых ПЦР, для практических целей всё более желательным становится одновременное выявление нескольких агентов, вызывающих сходные или идентичные клинические синдромы и/или имеющих сходные эпидемиологические признаки.