Кометный тест для оценки повреждения и репарации ДНК: принципы, применение и ограничения

Кометный тест (гель-электрофорез отдельных клеток) представляет собой простой метод измерения разрывов ДНК в эукариотических клетках. Клетки, заключённые в агарозу на предметном стекле, лизируют с помощью детергента и высокой концентрации солей, в результате чего образуются нуклеоиды, содержащие сверхспиральные петли ДНК, связанные с ядерным матриксом. Электрофорез при высоком значении pH приводит к формированию структур, напоминающих кометы, которые визуализируют методом флуоресцентной микроскопии; интенсивность хвоста кометы относительно её головки отражает количество разрывов ДНК. Вероятно, это обусловлено тем, что петли, содержащие разрыв, теряют сверхспирализацию и могут свободно вытягиваться в направлении анода. Метод применяют для оценки генотоксичности новых химических веществ, мониторинга загрязнения окружающей среды генотоксикантами, биомониторинга человека и молекулярно-эпидемиологических исследований, а также в фундаментальных исследованиях повреждения и репарации ДНК. Чувствительность и специфичность теста значительно повышаются при инкубации нуклеоидов с бактериальными эндонуклеазами репарации, распознающими определённые виды повреждений ДНК и превращающими эти повреждения в разрывы ДНК, что увеличивает количество ДНК в хвосте кометы. Репарацию ДНК можно оценивать после воздействия повреждающего агента: клетки инкубируют в течение определённого времени, а затем через заданные интервалы измеряют сохраняющийся уровень повреждения. Другой подход заключается в оценке репаративной активности клеточного экстракта при его инкубации с нуклеоидами, содержащими определённые повреждения.