TGF-β1 индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) альвеолярных эпителиальных клеток человека

Введение: Фибробластические фокусы являются характерным признаком лёгочной паренхимы у пациентов с идиопатическим лёгочным фиброзом (ИЛФ). Они представляют собой скопления мезенхимных клеток, расположенные в участках сохраняющегося повреждения эпителия и связанные с прогрессированием фиброза. Однако происхождение этих мезенхимных клеток остаётся неясным. Мы изучили, способен ли мощный фиброгенный цитокин TGF-β1 индуцировать эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) в клеточной линии альвеолярных эпителиальных клеток человека A549, а также исследовали сигнальный путь, опосредующий ЭМП под действием TGF-β1.

Методы: После воздействия TGF-β1 клетки A549 исследовали на наличие признаков ЭМП. ЭМП оценивали по морфологии клеток при фазово-контрастной микроскопии, а также по данным вестерн-блоттинга лизатов клеток, определяя экспрессию маркеров мезенхимного фенотипа, включая фибронектин EDA (Fn-EDA), и маркеров эпителиального фенотипа, включая E-кадгерин (E-cad). Дополнительно оценивали маркеры фиброгенеза, в том числе коллагены и соединительнотканный фактор роста (CTGF): уровень мРНК определяли методом ОТ-ПЦР, а содержание белка — методом иммунофлуоресценции или вестерн-блоттинга. Сигнальные пути, участвующие в ЭМП, характеризовали по данным вестерн-блоттинга лизатов клеток с использованием моноклональных антител для выявления фосфорилированных Erk1/2 и Smad2 после воздействия TGF-β1 в присутствии или отсутствии ингибиторов MEK. Роль Smad2 в опосредованном TGF-β1 ЭМП исследовали с помощью малых интерферирующих РНК.

Результаты: TGF-β1, но не TNF-α и IL-1β, индуцировал у клеток A549, обладающих фенотипом альвеолярных эпителиальных клеток II типа, ЭМП, зависимый от времени и концентрации. ЭМП сопровождался морфологическими изменениями, экспрессией маркеров фибробластного фенотипа Fn-EDA и виментина, а также снижением экспрессии маркера эпителиального фенотипа E-cad. Кроме того, в клетках, претерпевших ЭМП, повышалась экспрессия маркеров фиброгенеза, включая коллагены I и III типов и CTGF. Также выявлялась экспрессия MMP-2. Индуцированный TGF-β1 ЭМП происходил за счёт фосфорилирования Smad2 и подавлялся при выключении гена Smad2; ингибиторы MEK не ослабляли ни связанное с ЭМП фосфорилирование Smad2, ни наблюдавшиеся фенотипические изменения.

Выводы: TGF-β1 индуцирует ЭМП альвеолярных эпителиальных клеток A549 посредством активации Smad2. Полученные данные подтверждают возможность ЭМП в эпителиальных клетках лёгких и указывают на необходимость дальнейшего изучения этого процесса.