Новые подходы к снижению взаимодействия праймеров и устранению ингибиторов в мультиплексной ПЦР: пример тест-системы для выявления трёх вирусов земляники

Мультиплексная ПЦР — важный метод одновременного выявления различных патогенов в одной реакции. Предыдущие исследования были посвящены оптимизации факторов, влияющих на надёжность мультиплексной ПЦР, включая дизайн праймеров, состав реакционной смеси и условия проведения ПЦР, а также ингибиторы в образцах. В настоящем исследовании взаимодействие праймеров, приводящее к образованию сложных вторичных структур, включая видимые димеры и невидимые «праймерные кластеры» — новый тип вторичной структуры праймеров, выявленный в ходе этой работы, — оказалось важнейшим фактором, влияющим на успешность мультиплексной ПЦР. Были проверены подходы к снижению взаимодействия праймеров и устранению ингибиторов: уменьшение концентрации праймеров, особенно обеспечивающих преимущественную амплификацию; снижение температуры элонгации; увеличение времени элонгации и числа циклов ПЦР; добавление бычьего сывороточного альбумина. На основе этих подходов разработали мультиплексную ОТ-ПЦР для выявления вируса кольцевой пятнистости малины, вируса скрытой кольцевой пятнистости земляники и вируса кустистой карликовости томата; её чувствительность была сопоставима с чувствительностью отдельных реакций ПЦР для каждого вируса. В реакцию также включили внутренний контроль амплификации растительного материала. Эти подходы могут служить руководством при разработке протоколов мультиплексной ПЦР для выявления других патогенов и организмов, связанных с растениями, человеком, животными и окружающей средой.