Характеристика и функция гена 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы частухи восточной (Alisma orientale (Sam.) Juz.) и его связь с продукцией протостановых тритерпенов

Протостановые тритерпены частухи восточной (Alisma orientale (Sam.) Juz.) обладают выраженными фармакологическими свойствами и пользуются высоким спросом. 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктаза (HMGR) считается первым ферментом, лимитирующим скорость биосинтеза изопреноидов по мевалонатному пути. В этом исследовании клонирована полноразмерная кДНК HMGR частухи восточной (AoHMGR; 2252 п. н.; номер доступа GenBank KP342318) с открытой рамкой считывания длиной 1809 п. н. Выведенная аминокислотная последовательность содержала четыре консервативных мотива и была гомологична последовательностям HMGR других растений. Затем клонированный ген экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21 (Rosetta), выделили продукт экспрессии и инкубировали его с 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА (HMG-CoA) для определения ферментативной активности. Анализ методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии показал, что полученный белок катализировал превращение HMG-CoA в мевалоновую кислоту (MVA) с участием NADPH. Очищенный белок использовали для иммунизации новозеландских кроликов и получения антител к AoHMGR. Результаты иммуноблоттинга показали, что антитела специфически распознавали белок AoHMGR в частухе восточной. Затем был разработан экспресс-метод выявления AoHMGR в растении; наибольшее содержание белка обнаружили в клубне. Кроме того, на разных этапах роста частухи восточной определяли уровень экспрессии AoHMGR и содержание основного активного компонента — алисола B 23-ацетата. Выявлена значимая положительная корреляция, указывающая на ключевую роль AoHMGR в биосинтезе протостановых тритерпенов.