Целевой захват генов и секвенирование нового поколения для уточнения статуса ALK при расхождении результатов FISH и ИГХ у пациентов с аденокарциномой лёгкого

Введение: Проведено геномное исследование случаев аденокарциномы лёгкого с расхождением результатов определения статуса гена рецепторной тирозинкиназы анапластической лимфомы (ALK) методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и иммуногистохимии (ИГХ).

Методы: ДНК из образцов тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин, 16 случаев с расхождением результатов (четыре случая FISH-положительные/ИГХ-отрицательные и 12 случаев FISH-отрицательные/ИГХ-положительные по результатам тестирования с помощью набора Vysis ALK Break Apart FISH и ИГХ с клоном ALK1) исследовали методом захвата целых генов с последующим секвенированием нового поколения (NGS) девяти генов: ALK, гена белка 4, ассоциированного с микротрубочками иглокожих (EML4), гена члена семейства кинезинов 5B (KIF5B), гена нуклеазы стафилококка с доменом Tudor 1 (SND1), BRAF, протоонкогена RET, гена эзрина (EZR), ROS1 и теломеразной обратной транскриптазы (TERT). Во всех случаях с расхождением результатов, кроме одного FISH-отрицательного/ИГХ-положительного случая с недостаточным количеством ткани, дополнительно выполнили ИГХ с антителом D5F3. В одном случае с образцом свежезамороженной ткани также провели секвенирование всего транскриптома. В качестве контроля включили 26 случаев с совпадающими результатами (16 FISH-положительных/ИГХ-положительных и 10 FISH-отрицательных/ИГХ-отрицательных).

Результаты: В четырёх случаях FISH-положительного/ИГХ-отрицательного статуса ALK методом NGS не выявили слияния EML4-ALK. Однако в одном случае, исследованном на свежезамороженной ткани, обнаружили слияния EML4-BIRC6 (гена, содержащего повторы AIP бацуловируса) и AAK1-ALK (гена киназы 1, ассоциированной с AP2). Секвенирование всего транскриптома выявило высокую экспрессию транскрипта слияния EML4-BIRC6 и минимальную экспрессию транскрипта AAK1. В 12 случаях FISH-отрицательного/ИГХ-положительного статуса признаков перестройки гена ALK методом NGS не обнаружили. В 11 из 12 случаев, положительных при ИГХ с клоном ALK1, повторное исследование с антителом D5F3 дало совпадающий с FISH отрицательный результат (то есть FISH-отрицательный/ИГХ-отрицательный статус при использовании клона D5F3). Среди 16 контрольных случаев с положительными результатами FISH и ИГХ захват целых генов выявил слияние ALK в 15 случаях, в том числе HIP1-ALK (ген белка 1, взаимодействующего с huntingtin) в одном случае. Ни в одном из 10 случаев с отрицательными результатами FISH и ИГХ слияния ALK не обнаружили. Также выявили другие гены слияния с участием ROS1, EZR, BRAF и SND1.

Выводы: Результаты FISH на ALK, по-видимому, были ложноположительными в трёх из четырёх случаев с отрицательной ИГХ. Среди 12 случаев с отрицательным результатом FISH и положительной ИГХ с клоном ALK1 ложноотрицательных результатов FISH не выявили; это согласуется с совпадающим отрицательным результатом FISH и ИГХ с клоном D5F3. Предложенный подход к захвату целых генов в образцах, фиксированных формалином и залитых в парафин, оказался эффективным для выявления перестроек ALK и других терапевтически значимых онкогенов.