Метод выделения и обогащения экзосом из коровьего молока с высокой степенью очистки

Экзосомы — это нановезикулы, играющие важную роль в межклеточной коммуникации за счёт переноса информации к клеткам-мишеням. Выделение экзосом высокой степени чистоты позволяет изучать их содержимое и количество, а также особенности передачи специфических для клеток сигналов. Мы описываем новый метод обогащения экзосом из молока среди внеклеточных везикул с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Сначала внеклеточные везикулы выделяли из коровьего молока в ходе его обработки и ультрацентрифугирования, затем экзосомы обогащали новым методом с применением SEC. Этот метод сравнивали с широко используемым способом обогащения — центрифугированием в градиенте плотности. Экзосомы характеризовали по концентрации и размеру частиц (анализ траекторий наночастиц, NTA), морфологии (просвечивающая электронная микроскопия, TEM), наличию маркеров экзосом (иммуноблоттинг) и концентрации белка (анализ с бицинхониновой кислотой, BCA). Протеомные профили фракций экзосом анализировали методом масс-спектрометрии в режиме зависимого от данных сбора спектров. Во фракциях экзосом из молока обнаружены маркеры экзосом флотиллин-1 (FLOT-1) и ген восприимчивости к опухолям 101 (TSG-101). Новый метод обеспечил больший выход экзосом, чем центрифугирование в градиенте плотности. Сохранность морфологии в объединённых фракциях экзосом подтверждена методом TEM. Применение SEC подтвердило разделение экзосом по размеру при минимальном влиянии белков. В экзосомных фракциях методом масс-спектрометрии обнаружены тетраспанины CD9 и CD81. Этот новый эффективный метод подтвердил наличие характерных маркеров экзосом, выделенных из непастеризованного коровьего молока. Очистка экзосом — основополагающий метод при изучении биомаркеров патологических состояний и разработке эффективных систем доставки лекарств.