Ферментативное секвенирование метилирования выявляет метилирование ДНК на уровне отдельных оснований, начиная с пикограммовых количеств ДНК

Бисульфитное секвенирование позволяет выявлять 5-метилцитозин (5mC) и 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) на уровне отдельных оснований. Однако обработка бисульфитом повреждает ДНК, вызывая её фрагментацию, потерю ДНК и систематическое смещение данных секвенирования. Для устранения этих проблем был разработан метод ферментативного секвенирования метилирования (EM-seq). Он выявляет 5mC и 5hmC с помощью двух последовательных ферментативных реакций. В первой реакции TET2 и T4-BGT превращают 5mC и 5hmC в продукты, не подвергающиеся дезаминированию APOBEC3A. Во второй реакции APOBEC3A дезаминирует немодифицированные цитозины, превращая их в урацилы. Таким образом, эти три фермента позволяют идентифицировать 5mC и 5hmC. Библиотеки EM-seq сравнивали с библиотеками из ДНК, обработанной бисульфитом; в обоих случаях адаптеры Illumina лигировали до проведения соответствующей реакции преобразования. Библиотеки создавали из геномной ДНК NA12878, внеклеточной ДНК и ДНК из фиксированных формалином и залитых парафином образцов при различном количестве исходной ДНК. Профили 5mC и 5hmC в библиотеках EM-seq были сходны с профилями в бисульфитных библиотеках. Однако библиотеки EM-seq превосходили библиотеки из ДНК, обработанной бисульфитом, по всем оцененным показателям, включая охват, дупликацию и чувствительность. Для библиотек EM-seq выявляли более равномерное распределение GC, более высокую согласованность результатов при разном количестве исходной ДНК, большее число CpG-сайтов в геномных элементах и более точное определение метилирования цитозинов. Метод EM-seq был эффективен при использовании всего 100 пг ДНК; созданные при этом библиотеки сохраняли перечисленные преимущества перед бисульфитным секвенированием. Создание библиотек EM-seq из сложных образцов при малом количестве исходной ДНК открывает новые возможности для научных исследований и клинического применения.