Разреживание в настоящее время является лучшим методом контроля неравномерной глубины секвенирования при анализе ампликонных последовательностей

Поскольку в одном исследовании число последовательностей гена 16S рРНК в разных образцах может различаться в 100 раз, необходимо учитывать влияние неодинакового объёма секвенирования. Оптимальный способ сделать это остаётся предметом дискуссий. Некоторые исследователи считают разреживание «недопустимым», поскольку при этом отбрасываются достоверные данные. Для нормализации и масштабирования данных разработан ряд альтернативных методов, которые, как утверждается, не зависят от числа наблюдений. Я сформировал распределения сообществ на основе 12 опубликованных наборов данных, что позволило оценить способность различных методов контролировать неодинаковый объём секвенирования. Разреживание оказалось единственным методом, способным контролировать вариации объёма секвенирования при расчёте широко используемых показателей α- и β-разнообразия. Затем я сравнил частоту ложного обнаружения и статистическую мощность выявления истинных различий между смоделированными сообществами с известным размером эффекта с использованием различных показателей α- и β-разнообразия. Хотя все методы контроля неодинакового объёма секвенирования обеспечивали приемлемую частоту ложного обнаружения при случайном распределении образцов по двум группам лечения, только разреживание стабильно позволяло учитывать различия в объёме секвенирования, когда глубина секвенирования была связана с группой лечения. Наконец, статистическая мощность выявления различий по показателям α- и β-разнообразия стабильно была максимальной при использовании разреживания. Результаты этих симуляций подчёркивают важность разреживания для выравнивания числа последовательностей в образцах при анализе ампликонных последовательностей.

Значимость: Секвенирование фрагментов гена 16S рРНК стало основным инструментом изучения разнообразия микробных сообществ и факторов, влияющих на него. Из-за технических сложностей число последовательностей, полученных из разных образцов одного исследования, часто существенно различается. Однако показатели разнообразия, используемые микробными экологами, чувствительны к различиям в объёме секвенирования. Поэтому необходимы методы контроля неодинаковой глубины секвенирования. Этот анализ на основе симуляций показывает, что, несмотря на длительную дискуссию, разреживание является наиболее надёжным методом контроля неодинакового объёма секвенирования. Дискуссия возникла из-за путаницы в определении разреживания и нарушения допущений, лежащих в основе методов, заимствованных из других областей. Микробным экологам следует использовать разреживание.