Повышение экспрессии let-7 в фолликулярной жидкости пациенток с эндометриомами яичников нарушает функцию клеток гранулёзы за счёт воздействия на IGF1R

Вопрос исследования: Какие молекулярные механизмы лежат в основе снижения овариального резерва, проявляющегося уменьшением количества и качества ооцитов у пациенток с эндометриомами яичников?

Краткий ответ: Повышенная экспрессия микроРНК семейства let-7 в фолликулярном микроокружении яичников с эндометриомами подавляет экспрессию рецептора инсулиноподобного фактора роста 1-го типа (IGF1R) в клетках гранулёзы и нарушает их пролиферацию, секрецию стероидных гормонов, энергетический обмен с участием аденозинтрифосфата (АТФ) и уровень окислительного стресса, связанного с активными формами кислорода.

Что известно: У пациенток с эндометриомами яичников снижен овариальный резерв, что проявляется уменьшением количества и качества ооцитов. Фиброзные изменения ткани яичника вокруг эндометриомы создают неблагоприятное микроокружение для роста и развития фолликулов.

Дизайн, объём и продолжительность исследования: Это поперечное исследование было направлено на выяснение молекулярных механизмов влияния эндометриом яичников на развитие фолликулов. Сначала методом секвенирования изучили профили экспрессии микроРНК в образцах фолликулярной жидкости пациенток с бесплодием, связанным с эндометриомами яичников (N = 3), и с бесплодием, обусловленным мужским фактором (N = 3; контрольная группа). Для подтверждения наличия микроРНК-кандидатов провели валидацию на дополнительных образцах из обеих групп (эндометриомы яичников — N = 55, мужской фактор — N = 45). Кроме того, in vitro исследовали показатели дисфункции клеток гранулёзы на клетках крыс. Затем создали модели эндометриом яичников у крыс методом аллогенной трансплантации эндометрия и провели эксперименты по оценке фертильности, чтобы изучить реакцию оси let-7/IGF1R на эндометриомы яичников in vivo. Образцы пациенток собирали с мая 2018 по апрель 2019 года, а механистическое исследование проводили в течение последующих трёх лет.

Участники, материалы, условия и методы: Образцы фолликулярной жидкости и клеток гранулёзы получили от пациенток с бесплодием, связанным с эндометриомами яичников или мужским фактором, проходивших лечение методом ЭКО. Профили экспрессии микроРНК в образцах фолликулярной жидкости анализировали методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, а микроРНК-кандидаты валидировали количественной ПЦР. В экспериментах in vitro на клетках гранулёзы крыс пролиферацию оценивали с помощью теста CCK-8, концентрации стероидных гормонов измеряли хемилюминесцентным методом, содержание АТФ — с помощью набора для её определения, а уровень активных форм кислорода — методом проточной цитометрии. Для выявления гена-мишени let-7 провели анализ с использованием репортёрного гена с двойной люциферазой: плазмиду с репортёрным геном IGF1R конструировали и исследовали в клетках 293T. Экспрессию IGF1R в клетках гранулёзы, а также нижележащих белков и изменения сигнальных путей после трансфекции агонистом или антагонистом let-7 и/или подавления экспрессии Igf1r оценивали методом вестерн-блоттинга. В моделях эндометриом яичников у крыс изменения структуры яичников и морфологии кист изучали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Экспрессию let-7 и Igf1r в клетках гранулёзы оценивали методом количественной ПЦР, а изменения экспрессии IGF1R — иммуногистохимическим методом.

Основные результаты и роль случайности: У пациенток с эндометриомами яичников число антральных фолликулов, количество полученных ооцитов и частота нормального оплодотворения были значимо ниже, чем в контрольной группе с мужским фактором бесплодия. Экспрессия микроРНК семейства let-7 была значительно повышена в фолликулярной жидкости и клетках гранулёзы пациенток с эндометриомами. Трансфекция клеток гранулёзы крыс агонистами let-7 нарушала их функции, в том числе пролиферацию, митохондриальное окислительное фосфорилирование и секрецию стероидных гормонов; трансфекция антагонистами let-7 вызывала противоположные эффекты. Эксперименты с репортёрным геном подтвердили комплементарное связывание let-7 с нетранслируемыми областями 3′ IGF1R. Стимуляция экспрессии let-7 в клетках гранулёзы крыс приводила к значимому снижению экспрессии IGF1R, тогда как подавление let-7 повышало её. Экспрессия IGF1R в клетках гранулёзы пациенток с эндометриомами также была значимо ниже, чем у пациенток с бесплодием, обусловленным мужским фактором. Подавление Igf1r вызывало дисфункцию клеток гранулёзы, сходную с эффектом активации let-7: снижалась экспрессия ключевых белков, участвующих в пролиферации клеток (CCND2 и CCND3) и синтезе эстрадиола, а синтез прогестерона (StAR) повышался; в процесс вовлекались сигнальные пути PI3K-Akt и MAPK. Антагонистическое действие let-7 на клетки гранулёзы не проявлялось при подавлении Igf1r. Напротив, стимулирующее действие агониста let-7 на клетки гранулёзы можно было устранить с помощью лиганда IGF1R — IGF-1. Эти результаты указывают, что let-7 регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток гранулёзы, а также синтез АТФ, воздействуя на IGF1R. В модели эндометриом яичников у крыс наблюдались изменения морфологии и структуры яичников, а также снижение фертильности. По сравнению со здоровыми крысами экспрессия let-7 в клетках гранулёзы крыс с эндометриомами была значительно повышена, а экспрессия Igf1r и IGF1R в клетках гранулёзы преовуляторных фолликулов — заметно снижена. Это подтверждает предположение, что повышение экспрессии let-7 в фолликулярном микроокружении при эндометриомах подавляет IGF1R, нарушает функцию клеток гранулёзы и влияет на фертильность на молекулярном уровне.

Данные крупномасштабных исследований: Не применимо.

Ограничения и причины для осторожной интерпретации: Механизмы синтеза и секреции стероидных гормонов сложны. Некоторые ферменты, регулирующие синтез эстрогенов, участвуют также в синтезе прогестерона. Кроме того, определённые рецепторы могут отвечать на сигналы нескольких гормонов. Поэтому на экспрессию ключевых ферментов, таких как CYP17A, CYP11A1, HSD3B2 и StAR, и рецепторов, включая AR, LHCGR, FSHR и ESR2, могли влиять различные факторы, и её изменения могли быть не вполне согласованными.

Общее значение результатов: В дальнейших исследованиях планируется изучить возможное влияние стромальных клеток яичника на внешнее микроокружение, в котором растут фолликулы. Кроме того, можно проводить скрининг низкомолекулярных препаратов, воздействующих на let-7 и IGF1R, чтобы изменить микроокружение яичника и в конечном счёте улучшить его функцию.

Финансирование и конфликт интересов: Исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (грант 82301851 для L.B.S., гранты U23A20403 и U20A20349 для S.Y.Z. и грант 82371637 для Y.D.D.) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант LTGY23H040010 для F.Z.). Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.