Очистка и характеристика фермента удлинения цепи олигосахаридов семейства раффинозы — галактан:галактан-галактозилтрансферазы (GGT) — из листьев Ajuga reptans

Галактан:галактан-галактозилтрансфераза (GGT) — фермент, участвующий в биосинтезе длинноцепочечных олигосахаридов семейства раффинозы (RFO) у Ajuga reptans. Он катализирует перенос α-галактозильного остатка с одной молекулы RFO на другую, образуя следующий более высокий олигомер RFO. Этот новый, независимый от галактинола (α-галактозил-мио-инозитола) α-галактозилтрансферазный фермент отвечает за накопление длинноцепочечных RFO in vivo. Тёплая инкубация (20 °C) отделённых листьев привела через 28 дней к 34-кратному увеличению концентрации RFO и 200-кратному увеличению активности GGT. При холодовой обработке (10 °C/3 °C днём/ночью) эти показатели увеличились соответственно в 26 и 130 раз. Полученные данные подтверждают роль GGT как ключевого фермента синтеза и накопления длинноцепочечных RFO. GGT очищали из листьев в четыре этапа, включавшие фракционное осаждение сульфатом аммония, а также аффинную хроматографию на лектинах, анионообменную и гель-фильтрационную хроматографию; степень очистки составила 200 раз. Очищенный GGT имел изоэлектрическую точку 4,7 и оптимум pH около 5; скорость реакции переноса демонстрировала насыщаемую зависимость от концентрации обоих субстратов — раффинозы (Km = 42 мМ) и стахиозы (Km = 58 мМ). GGT представляет собой гликопротеин, углеводная часть которого составляет 10%. Нативная молекулярная масса, определённая методом гель-фильтрации, составляла 212 кДа. После разделения методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрического фокусирования очищенный GGT выявлялся в виде единственной активной полосы, тогда как при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии SDS разделялся на три полосы с молекулярной массой 48, 66 и 60 кДа. Аминокислотные последовательности четырёх триптических пептидов, полученных из основной полосы массой 48 кДа, имели высокую степень гомологии с последовательностями растительных α-галактозидаз (EC 3.2.1.22). Однако GGT отличался от α-галактозидаз по субстратной специфичности: он не гидролизовал и не переносил α-галактозильные группы с мелибиозы, галактинола, UDP-галактозы, маннинотриозы и маннинотетроза. Галактинол, сахароза и галактоза существенно ингибировали реакцию GGT при концентрации 10–50 мМ.