Клонирование, функциональная экспрессия и характеристика фермента удлинения цепи олигосахаридов семейства раффинозы — галактан:галактан-галактозилтрансферазы — из листьев живучки ползучей

Галактан:галактан-галактозилтрансфераза (GGT) — уникальный фермент биосинтетического пути олигосахаридов семейства раффинозы. Он катализирует удлинение цепей олигосахаридов семейства раффинозы без участия галактинола (α-галактозилмиоинозитола), просто перенося концевой α-галактозильный остаток с одной молекулы олигосахарида семейства раффинозы на другую. В настоящей работе описаны клонирование и функциональная экспрессия кДНК, кодирующей GGT, из листьев живучки ползучей (Ajuga reptans) — зимостойкого представителя семейства яснотковых, накапливающего длинноцепочечные олигосахариды семейства раффинозы. КДНК содержит открытую рамку считывания длиной 1215 п. о. Экспрессия в протопластах табака (Nicotiana plumbaginifolia) привела к образованию функционального рекомбинантного белка, обладавшего активностью GGT, сходной с активностью ранее описанного очищенного природного фермента GGT. На уровне аминокислотной последовательности GGT имеет высокое сходство (>60%) с кислыми α-галактозидазами растений, относящимися к 27-му семейству гликозилгидролаз. При этом он явно отличается от представителей 36-го семейства гликозилгидролаз, к которому относятся галактинолзависимые синтазы раффинозы и стахиозы, а также щелочные α-галактозидазы. Физиологические исследования роли GGT подтвердили, что этот фермент играет ключевую роль в удлинении цепей олигосахаридов семейства раффинозы и запасании углерода. При воздействии низких температур на отделённые от растения листья одновременно повышались уровни транскриптов GGT, активность фермента и концентрации длинноцепочечных олигосахаридов семейства раффинозы. На уровне целого растения низкие температуры индуцировали экспрессию GGT преимущественно в корнях и полностью сформировавшихся листьях — органах живучки ползучей, известных как места хранения олигосахаридов семейства раффинозы. Это указывает на перестройку метаболизма при холоде: переход от активного роста к временному запасанию.