Новый колориметрический тест цитотоксичности для скрининга противоопухолевых препаратов

Мы разработали быстрый, чувствительный и недорогой метод измерения содержания клеточного белка в адгезивных и суспензионных культурах в 96-луночных микротитровальных планшетах. Метод пригоден для обычных лабораторных целей и для крупномасштабных применений, таких как ориентированный на заболевания in vitro-скрининг Национального института рака США для поиска противоопухолевых препаратов, для которого ежегодно требуются миллионы лунок с культурами. Культуры, фиксированные трихлоруксусной кислотой, окрашивали в течение 30 минут 0,4%-ным (масса/объем) сульфородамином B (SRB), растворенным в 1% уксусной кислоте. Несвязавшийся краситель удаляли четырьмя промывками 1% уксусной кислотой, а связанный с белком краситель экстрагировали 10 мМ небуферизованным основанием Tris [трис(гидроксиметил)аминометан] для определения оптической плотности в подключенном к компьютеру считывателе 96-луночных микротитровальных планшетов. Результаты SRB-теста линейно зависели от числа клеток и от содержания клеточного белка, измеренного как по методу Лоури, так и по методу Бредфорда, в диапазоне плотностей от низкой субконфлюентности до многослойной суперкoнфлюентности. Отношение сигнал/шум при 564 нм составляло примерно 1,5 при 1000 клеток в лунке. Чувствительность SRB-теста была сопоставима с чувствительностью нескольких флуоресцентных методов и превосходила чувствительность как методов Лоури и Бредфорда, так и 20 других видимых красителей. SRB-тест дает колориметрический конечный результат, который не разрушает образец, сохраняется неопределенно долго и виден невооруженным глазом. Он позволяет чувствительно оценивать цитотоксичность, индуцированную лекарствами, полезен для количественной оценки клоногенности и хорошо подходит для высокопроизводительного автоматизированного скрининга препаратов. При лазерном возбуждении на 488 нм SRB дает сильную флуоресценцию и может быть количественно измерен на уровне одной клетки методом статической флуоресцентной цитометрии.