Высокоуровневая внеклеточная продукция рекомбинантной наттокиназы в Bacillus subtilis WB800 с использованием нескольких тандемных промоторов

Введение: Наттокиназа (NK), относящаяся к семейству субтилизинов, представляет собой мощный фибринолитический фермент, который может применяться для лечения тромбозов. Для повышения её продукции в пищевой промышленности были проведены обширные исследования. Целью настоящей работы было увеличение продукции NK с помощью тандемных промоторов в Bacillus subtilis WB800.

Результаты: Были сконструированы шесть рекомбинантных штаммов, несущих различные плазмиды с одиночным промотором. Анализ фибринолитической активности показал, что промоторы P43 и PHpaII обеспечивали более высокую экспрессию по сравнению с другими промоторами. Выход NK при использовании P43 и PHpaII составил соответственно 140,5 ± 3,9 FU/мл и 110,8 ± 3,6 FU/мл. Для повышения уровня экспрессии NK эти промоторы объединили в тандемные конструкции. Полученные результаты показали, что порядок расположения промоторов в тандеме непосредственно влияет на уровень экспрессии NK. По мере увеличения числа повторов P43 или PHpaII уровень экспрессии NK повышался до трёх промоторов, но дальнейшее увеличение их числа не приводило к постоянному росту экспрессии. Кроме того, повторяющиеся основные участки P43 или PHpaII эффективно повышали продукцию NK. Были сконструированы восемь вариантов тройных промоторов с различным порядком расположения P43 и PHpaII; максимальный выход NK составил 264,2 ± 7,0 FU/мл при использовании конструкции P43–PHpaII–P43. Масштабирование продукции NK с этой конструкцией также провели в ферментёре объёмом 5 л; активность NK достигла 816,7 ± 30,0 FU/мл.

Выводы: В Bacillus subtilis эффективная сверхпродукция NK была достигнута с использованием тандемных промоторов. Наиболее высокую фибринолитическую активность обеспечивала конструкция P43–PHpaII–P43; полученный показатель значительно превышал значения, описанные в предыдущих исследованиях. Несколько тандемных промоторов успешно использовали для регуляции экспрессии NK, и этот подход может применяться для повышения экспрессии других генов.