Один, два, три цикла замораживания: жизнеспособность и исходы после переноса свежих и витрифицированных с последующим согреванием эмбрионов мыши

Вопрос исследования: Какое влияние оказывают один, два или три цикла витрификации и согревания на жизнеспособность эмбрионов, потенциал имплантации и развитие после переноса по сравнению со свежим переносом?

Краткий ответ: Повторные циклы витрификации и согревания последовательно ухудшали криовыживаемость эмбрионов, качество бластоцист и рост плода после двух и более циклов.

Что уже известно: Криоконсервация имеет ключевое значение для хранения эмбрионов и предимплантационного генетического тестирования, когда эмбрионы подвергают биопсии и замораживают в ожидании результатов. Однако влияние повторных циклов витрификации и согревания остается неясным из-за смешивающих факторов, включая эффекты биопсии, предшествующую неудачу имплантации, отсутствие истинного контроля без криоконсервации и сравнение со свежим переносом, осложненное супрафизиологическим гормональным воздействием.

Дизайн исследования, объем, продолжительность: Чтобы преодолеть ограничения клинических исследований, в качестве контролируемой доклинической модели использовали мышь. Это позволило точно контролировать стадию эмбриона при криоконсервации и протокол витрификации, а также напрямую сравнить результаты с невитрифицированной (свежей) контрольной группой без влияния супрафизиологического гормонального воздействия или биопсии. Несмотря на признанные межвидовые различия, эта модель позволяет целенаправленно оценить эффекты, специфичные для криоконсервации. Исходами были выживаемость после согревания, распределение клеточных линий, а также исходы после переноса эмбрионов на 18,5-й день развития (частота наступления беременности и имплантации, масса плода и плаценты). Выживаемость после согревания оценивали после одного, двух или трех циклов замораживания и согревания (3035, 1465 и 447 бластоцист соответственно; 23 независимые экспериментальные репликации). Количество клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофэктодермы (ТЭ) определяли после одного, двух или трех циклов замораживания и согревания и сравнивали со свежим (невитрифицированным) контролем (35, 36, 33 и 28 бластоцист соответственно; четыре независимые экспериментальные репликации). Исходы после переноса оценивали после одного, двух или трех циклов замораживания и согревания и сравнивали со свежим (невитрифицированным) контролем (30, 33, 39 и 22 псевдобеременные реципиентки соответственно). Объем выборки рассчитывали заранее, чтобы обеспечить достаточную статистическую мощность исследования.

Участники/материалы, условия, методы: Эмбрионы мышей получали после ЭКО и культивировали до стадии бластоцисты, после чего они проходили ноль (свежие), один, два или три повторных цикла витрификации и согревания. Выживаемость после согревания оценивали морфологически, а иммуногистохимическое окрашивание на OCT-3/4 (ВКМ) и CDX2 (ТЭ) использовали для оценки распределения клеточных линий. Перенос эмбрионов применяли для дальнейшей оценки их развития по частоте беременности, исходам имплантации (частота имплантации, частота жизнеспособной имплантации, частота резорбции), а также по эмбриональным и плацентарным исходам (масса плода, масса плаценты и соотношение массы плода к массе плаценты), измеренным на 18,5-й день развития.

Основные результаты и роль случайности: Криовыживаемость эмбрионов значимо снижалась с увеличением числа циклов замораживания и согревания; выраженное уменьшение отмечалось после двух или трех циклов по сравнению с одним циклом (P < 0,05), а доля нежизнеспособных эмбрионов после трех циклов была существенно выше (P < 0,001). Число клеток ВКМ значимо уменьшалось после двух или трех циклов по сравнению со свежими эмбрионами (P < 0,0001), тогда как число клеток ТЭ увеличивалось после двух циклов (P < 0,05). Соотношение ВКМ:ТЭ значимо снижалось после одного, двух или трех циклов по сравнению со свежими эмбрионами (P < 0,01). После переноса эмбрионов частота беременности во всех группах с замораживанием и согреванием была ниже, чем в свежем контроле, хотя различия не достигали статистической значимости. Относительный риск беременности по сравнению со свежим переносом составил 0,74 (95% ДИ 0,34–1,64) после одного цикла, 0,75 (95% ДИ 0,35–1,62) после двух циклов и 0,59 (95% ДИ 0,27–1,32) после трех циклов. Частота имплантации и жизнеспособной имплантации демонстрировала сходное недостоверное снижение, тогда как частота резорбции численно была выше после двух или трех циклов замораживания и согревания. По сравнению со свежей группой масса плода значимо снижалась после двух и трех циклов (P = 0,037 и P = 0,012), масса плаценты имела недостоверную тенденцию к увеличению, а соотношение массы плода к массе плаценты значимо уменьшалось после двух и трех циклов (P = 0,009 и P = 0,002). Хотя криовыживаемость, число клеток ВКМ и показатели роста плода демонстрировали отчетливые статистические эффекты, недостоверные показатели беременности, имплантации и резорбции указывают, что часть вариабельности после переноса может объясняться случайностью.

Ограничения, причины для осторожности: В исследовании использовали модель на мышах, и хотя процедуры соответствовали клинической практике, межвидовые различия требуют дальнейших механистических и трансляционных исследований для оценки применимости к репродукции человека. Кроме того, исследование было посвящено исключительно эмбрионам на стадии бластоцисты, что ограничивает применимость результатов к другим стадиям развития. Эффекты одного лишь воздействия криопротекторов не изучались.

Более широкое значение результатов: Полученные данные дают количественные доказательства кумулятивного влияния повторных циклов витрификации и согревания эмбрионов и могут помочь оптимизировать протоколы криоконсервации, ограничить ненужное повторное замораживание и способствовать уточнению клинических рекомендаций для улучшения жизнеспособности эмбрионов и исходов у плода при ЭКО.

Финансирование исследования/конфликт интересов: K.R.D. поддерживается стипендией Australian Research Council Future Fellowship (Adelaide University, FT240100291). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Регистрационный номер исследования: Н/Д.