От выявления с помощью ПГТ-М к механизму: функциональная валидация новых компаунд-гетерозиготных мутаций RAG1 при тяжёлом комбинированном иммунодефиците

Цель: Тяжёлый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) — жизнеугрожающее первичное иммунодефицитное заболевание. Целью исследования было выявить новые варианты гена 1, активирующего рекомбинацию (RAG1), в китайской семейной линии и охарактеризовать их влияние на структуру и функцию белка, чтобы обеспечить генетическую основу для цикла преимплантационного генетического тестирования на моногенное заболевание (ПГТ-М). Методы: Потенциальные мутации RAG1 у пробандов скринировали с помощью полноэкзомного секвенирования (WES) и подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Конформационные прогнозы вариантов выполняли с использованием SWISS-MODEL. Для оценки патогенности использовали PROVEAN, PolyPhen-2 и MutationTaster. Изогенные линии пре-B-клеток, несущие мутации, создавали методом редактирования CRISPR-Cas9 RNP. Функциональные последствия оценивали с помощью вестерн-блоттинга, анализа пролиферации и апоптоза. Результаты: У двух поражённых сибсов с типичной картиной ТКИД выявлены новые компаунд-гетерозиготные варианты RAG1 c.946T>G (p.C316G) и c.1197_1199del (p.L400del). Семейное генотипирование подтвердило аутосомно-рецессивный тип наследования: каждый из родителей был бессимптомным носителем одного из вариантов. Обе мутации были высококонсервативными и, по прогнозам, патогенными. Моделирование структуры показало нарушение вторичной и третичной структуры RAG1, влияющее на связывание цинка (p.C316G) и водородные связи (p.L400del). Функциональные исследования продемонстрировали выраженное снижение экспрессии белка RAG1, синергическое нарушение экспрессии RAG2 и значительное увеличение апоптоза в пре-B-клетках с двойной мутацией. Дополнительный анализ выявил дисрегуляцию сигнального пути PI3K/AKT1/FOXO1, о чём свидетельствовало повышение фосфорилирования AKT1 и FOXO1. Выводы: Исследование предоставляет генетические и функциональные доказательства того, что обе аллельные мутации RAG1 p.C316G и p.L400del синергически вызывают ТКИД за счёт дестабилизации белка, нарушения целостности комплекса RAG1/RAG2 и индукции апоптоза пре-B-клеток, вероятно опосредованной дисрегуляцией сигнального пути PI3K/AKT1/FOXO1. Эти данные расширяют спектр мутаций RAG1 и подтверждают клиническую целесообразность ПГТ-М для таких семей.