ITS как баркод экологической ДНК грибов: вычислительный подход выявляет потенциальные ПЦР-искажения

Введение: В последние 15 лет внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) ядерной ДНК используют как мишень для анализа разнообразия грибов в образцах из окружающей среды; недавно он был выбран в качестве стандартного маркера для ДНК-баркодирования грибов. В этом исследовании мы оценили потенциальные искажения амплификации, которые различные широко используемые праймеры к ITS могут вносить при амплификации разных участков ITS-региона в образцах со смешанными матрицами («экологическое баркодирование»). Мы провели вычислительный анализ ПЦР с наиболее употребимыми комбинациями праймеров, используя в качестве матриц различные наборы данных ITS, полученные из публичных баз данных.

Результаты: Для части праймеров к ITS, например ITS1-F, была характерна высокая доля несовпадений с целевыми последовательностями, и большинство из них, по-видимому, вносили таксономические искажения при ПЦР. Некоторые праймеры, например ITS1-F, ITS1 и ITS5, были смещены в сторону амплификации базидиомицетов, тогда как другие, например ITS2, ITS3 и ITS4, — в сторону амплификации аскомицетов. Предполагаемый праймер ITS4-B, специфичный для базидиомицетов, амплифицировал лишь небольшую долю ITS-последовательностей базидиомицетов даже в более мягких условиях ПЦР. Из-за систематических различий в длине как области ITS2, так и всего ITS аскомицеты амплифицируются легче, чем базидиомицеты, при использовании этих регионов в качестве мишени. Этого смещения можно избежать, если использовать праймеры, амплифицирующие только ITS1, но тогда возникает предпочтительная амплификация грибов, не относящихся к Dikarya.

Выводы: Мы заключаем, что праймеры к ITS необходимо подбирать очень тщательно, особенно при высокопроизводительном секвенировании образцов из окружающей среды. Мы предлагаем анализировать параллельно разные комбинации праймеров или разные участки ITS-региона либо искать альтернативные праймеры к ITS.