Точная коррекция гена дистрофина в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна с помощью TALEN и CRISPR-Cas9

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — тяжёлое заболевание с прогрессирующей дегенерацией мышц, обусловленное мутацией гена дистрофина. Коррекция генетического дефекта в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), полученных от пациентов, с помощью TALEN или CRISPR-Cas9 перспективна для генной терапии МДД, однако необходимо оценить безопасность применения таких нуклеаз. Используя уникальную базу данных k-меров, мы систематически выявили уникальный участок-мишень, позволяющий сократить число участков вне мишени. Для восстановления синтеза дистрофина в ИПСК пациентов с МДД мы применили три подхода к коррекции: пропуск экзона, сдвиг рамки считывания и встраивание экзона. Наиболее эффективным оказалось встраивание экзона. Целостность генома оценивали с помощью кариотипирования, анализа вариаций числа копий и секвенирования экзома, чтобы выявить клоны с минимальной мутационной нагрузкой. Затем скорректированные ИПСК дифференцировали в клетки скелетных мышц и успешно выявили экспрессию полноразмерного белка дистрофина. Полученные результаты могут послужить основой для разработки генной терапии наследственных заболеваний на основе ИПСК с применением программируемых нуклеаз.